沈智勇，陳瑜鳳，邵晶晶，沈愛軍，丁勇生，李 君

(南通市腫瘤醫(yī)院影像科，江蘇 南通 226361)

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤，療效差，死亡率高[1]。加強肝癌的防治研究，必要且迫切。建立一個合適的動物肝癌模型對于探索人類肝癌治療新方法有重要價值。常用的肝癌模型有皮下腫瘤模型及原位腫瘤模型[2 - 3]。皮下腫瘤模型方法簡便、可以直觀腫瘤生長。而原位腫瘤模型體現(xiàn)了人原發(fā)瘤浸潤的惡性行為和生長狀態(tài)，更接近人肝癌的生物學(xué)行為[4 - 6]。目前肝原位癌模型使用日益增多，但腫瘤接種后，判斷腫瘤生長狀況，動態(tài)觀察模型與病理的相關(guān)性，報道較少。故本研究使用瘤塊接種裸鼠肝，形成原位腫瘤后，使用超聲、MRI檢查，并與大體解剖、病理對比，以了解影像學(xué)診斷在監(jiān)測腫瘤生長中的價值，評估進行干預(yù)治療的合適時期。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

BALB/c裸鼠17只，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司[SCXK (滬) 2017-0005]，鼠齡為5～6周，體重20～22 g，均為雄性(雄裸鼠較雌裸鼠成瘤率高[7]，且避免激素依賴性干擾實驗結(jié)果[8])，分籠飼養(yǎng)于南通大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房[SYXK (蘇) 2017-0046]，滅菌水和飼料供動物自由攝入。實驗動物飼養(yǎng)及實驗處理均嚴格遵循南通大學(xué)動物中心實驗動物福利與倫理委員會相關(guān)指南要求(IACUC 20170303-002)。研究過程中做到按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2 細胞株

人肝癌細胞株HepG2(南通市腫瘤醫(yī)院中心實驗室提供)。

1.2 主要試劑與儀器

細胞培養(yǎng)基(DMEM)、BI血清、胰酶購自Hyclone公司；戊巴比妥鈉購自Sigma公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；超聲檢查儀購自美國Philips公司；MRI檢查儀購自德國Siemens公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 肝癌細胞復(fù)蘇及培養(yǎng)

液氮罐中取出HepG2，37℃水浴解凍。細胞移至離心管，滴加10% DMEM培養(yǎng)基。離心600 r/min 7 min。棄上清液，再加DMEM培養(yǎng)。待細胞長到密度約90%時，棄上清液，PBS兩次、加胰酶2 mL，消化3～5 min，待細胞變成圓形，呈漂浮狀態(tài)，再離心600 r/min 7 min，棄上清，滴加DMEM。共培養(yǎng)兩瓶，每瓶長滿約1×107個細胞。

1.3.2 裸鼠皮下腫瘤建模

收集已培養(yǎng)細胞，計數(shù)后調(diào)整濃度為每0.2 mL里包含1×107個細胞。取裸鼠2只，每只裸鼠右背部皮下注射細胞懸浮液0.2 mL。

1.3.3 裸鼠原位肝癌建模

待皮下移植瘤長到直徑約0.8 cm時，進行原位腫瘤建模。建模在SPF屏障環(huán)境內(nèi)進行。四位實驗醫(yī)師，分成兩組，每組兩人，同時進行，對15只裸鼠進行建模。無菌條件下分別切取2只裸鼠的皮下腫瘤，去除壞死組織后切成1 mm3瘤塊，麻醉裸鼠(戊巴比妥鈉，腹腔注射70 mg/kg)，以0.2%碘伏消毒裸鼠腹部，行右肋緣下斜切口，長約2 cm，打開腹腔、暴露肝，以10 mL注射器的針頭與肝右葉成15o角刺入肝被膜，深度約0.6 cm，無菌棉簽壓迫8 s止血，取上述一塊1 mm3瘤組織，用5 mL注射器針頭經(jīng)創(chuàng)口植入裸鼠肝右葉被膜下隧道內(nèi)，立即采用α-氰基丙烯酸酯快速醫(yī)用膠(OB醫(yī)用吻合膠)(廣州白云醫(yī)用膠有限公司，1 mL/支，廣東，中國)滴注隧道口，確保瘤塊無溢出，創(chuàng)面無出血，逐層關(guān)腹。每只裸鼠平均手術(shù)時間5～7 min。動物維持麻醉狀態(tài)30～40 min后清醒，送回籠中SPF條件飼養(yǎng)。

1.3.4 影像學(xué)監(jiān)測腫瘤生長

15只裸鼠建模后，于第4周隨機選擇5只裸鼠、第6周剩余10只中隨機選擇5只裸鼠、第8周最后剩余5只裸鼠分別進行影像學(xué)檢查，每次影像檢查后，處死裸鼠，不再送回屏障環(huán)境飼養(yǎng)。影像檢查包括超聲、MRI。超聲采用臨床用檢查病人的美國飛利浦公司Philips iu-22彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率12 MHz。裸鼠麻醉(戊巴比妥鈉70 mg/kg)后上腹部掃查，觀察肝聲像圖，仔細尋找肝內(nèi)異常回聲。MRI采用臨床用檢查病人的德國西門子公司Siemens Espree 3.0 T MRI，行常規(guī)平掃。裸鼠麻醉(戊巴比妥鈉70 mg/kg)后放置在動物專用特殊線圈內(nèi)(圖1)，進行T1WI、T2WI相檢查，發(fā)現(xiàn)T2WI較T1WI更加清晰顯示腫瘤，且掃查時間更短，故均以T2WI進行掃查。T2WI：TR3140 ms、TE81 ms、橫軸位層厚6 mm、層間距1 mm。FOV：64 mm×64 mm，base resolution：256。

圖1 裸鼠MRI線圈Figure 1 MRI coils for the nude mice

1.3.5 病理檢查

超聲、MRI檢查結(jié)束后，過量戊巴比妥鈉(腹腔注射100 mg/kg)處死裸鼠，解剖尸體，查看肝，仔細尋找是否有腫瘤存在，明確腫瘤數(shù)目、形態(tài)、包膜、腹腔有無轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)等。如有腫瘤，測量長徑。后取腫瘤，4%甲醛浸泡，送病理。石蠟包埋、HE染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

建模后對裸鼠肝腫瘤進行影像學(xué)、解剖測量。15只裸鼠分成三個不同時期，每期5只。每只裸鼠影像、解剖分別進行一次準確測量。先運用超聲、MRI測量腫瘤長徑(腫瘤最長徑的長度代替面積來代表腫瘤大小的一維測量法，或稱單徑測量法，可簡化測量步驟、提高準確性、減少誤差[9])。未見腫瘤顯示，數(shù)據(jù)以“0”表示。然后，處死裸鼠，大體標本測量腫瘤長徑，沒有成瘤的，肝腫瘤數(shù)據(jù)以“0”表示。解剖測量與超聲、MRI結(jié)果進行比較。計量資料，非正態(tài)分布，采用Wilcoxon秩和檢驗。以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 建模過程

使用1 mm3腫瘤組織塊通過肝創(chuàng)面進入隧道后，立即滴注微量(約0.05 mL)OB醫(yī)用膠，迅速形成淡淡的薄膜，封閉隧道口，2～3 s后膠體干燥。每只裸鼠的接種腫瘤的時間平均為6 min。術(shù)中平均出血量0.2～0.3 mL。通常鼠肝血供豐富，組織脆而易破，普通針眼易出血不止，種植的瘤塊易脫落、異位[10]。OB膠透明、粘接強度大[11]，迅速粘固鼠肝創(chuàng)面、無需縫合肝被膜，節(jié)約實驗時間。還可徹底止血、覆蓋腫瘤組織、避免瘤塊脫出[10]。

2.2 建模成瘤率

采用瘤塊接種15只裸鼠肝后，12只形成腫瘤，3只未成瘤。成瘤率80%。成瘤肝腫瘤均呈單發(fā)結(jié)節(jié)、邊界清晰、包膜完整。至第8周，肝內(nèi)未見轉(zhuǎn)移、腹腔未見轉(zhuǎn)移灶。

2.3 影像學(xué)結(jié)果

2.3.1 超聲結(jié)果

超聲檢出率為75%(9/12)。建模后第4周進行超聲檢查，4例成瘤肝超聲僅發(fā)現(xiàn)1例腫瘤，超聲顯示鼠肝見低回聲，邊界清，內(nèi)部回聲均勻(圖2)。其余3只未見明顯占位病變。6周時，鼠肝見邊界清晰的低回聲，圓形或橢圓形，內(nèi)部回聲均勻(圖3)。8周時，鼠肝見形態(tài)欠規(guī)則低回聲，內(nèi)部回聲不均勻，中心散在點狀強回聲、高回聲(圖4)。不同時期超聲測量結(jié)果見表1。

2.3.2 MRI結(jié)果

MRI檢出率為100%(12/12)。腫瘤接種4周后MRI監(jiān)測，T2WI顯示正常裸鼠肝為均勻低信號，腫瘤為高信號，邊界清晰，信號均勻(圖2)。6周時，T2WI右肝異常高信號，邊界清晰，其內(nèi)信號均勻(圖3)。8周時，T2WI示形態(tài)不規(guī)則的高信號，中心雜亂，分布不均，可見斑片狀低信號(圖4)。腫瘤壓迫周圍臟器組織。不同時期MRI測量結(jié)果見表1。

2.4 病理結(jié)果

大體形態(tài)學(xué)觀察：裸鼠解剖后，探查15只裸鼠肝，12只發(fā)現(xiàn)瘤結(jié)節(jié)，3只未發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)。成瘤結(jié)節(jié)邊界清晰，形態(tài)圓形、橢圓形或分葉狀，包膜完整。肝內(nèi)未見子灶、轉(zhuǎn)移灶。腹腔及其他臟器未見轉(zhuǎn)移灶，未見腹水。4周時肝癌結(jié)節(jié)平均長徑4 mm、6周時平均長徑7 mm、8周時平均長徑11 mm。見表1。

HE染色：4周時，瘤結(jié)節(jié)與正常肝分界清晰(箭頭示)。正常肝細胞清晰、排列整齊，無核分裂相，而腫瘤細胞排列成實性、片狀、異型性明顯，細胞核不規(guī)則，核仁易見，分裂相多見(圖2)。6周時HE染色顯示瘤細胞核大、排列致密、分布不均勻，未見壞死(圖3)。8周時示瘤細胞排列不齊、稀疏、分布不均，中心壞死明顯(圖4)。

表1 建模后裸鼠肝癌影像、解剖測量比較表(mm)

注：*超聲與解剖比較，P< 0.05，差異有顯著性；▲磁共振成像與解剖比較，P> 0.05，差異無顯著性。

Note.*There was a significant difference between US and anatomy measurement, withP< 0.05.▲There was no significant difference between MRI and anatomical measurement, withP> 0.05.

注：A、B、C、D分別為超聲、T2WI、解剖、HE染色(× 200，箭頭左側(cè)為正常肝細胞、右側(cè)為癌細胞)結(jié)果。圖2 建模后4周影像學(xué)與大體測量及病理對比Note. A-D: Results of ultrasound, T2WI, anatomical measurement, and HE staining (× 200, normal liver cells are on the left side of the arrows, carcinoma cells are on the right side), respectively.Figure 2 Imaging calculation, gross measurement, and pathological comparison at 4 weeks after model establishment

2.5 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

超聲檢查第4周漏診3例，測量結(jié)果以“0”表示，超聲全程測量的15個數(shù)據(jù)呈非正態(tài)分布，故統(tǒng)計采用秩和檢驗，超聲測量與解剖測量比較，P=0.0059。MRI未見漏診，MRI測量與解剖測量比較，P=0.208，差異無顯著性，表明MRI是全程監(jiān)測腫瘤生長的有效影像方法。

注：A、B、C、D分別為超聲、T2WI、解剖、HE染色(× 200)結(jié)果。圖3 建模后6周，影像學(xué)與大體測量及病理對比Note. A-D: Results of ultrasound, T2WI, anatomical measurement, and HE staining (×200), respectively.Figure 3 Imaging calculation, gross measurement, and pathological comparison of a tumor at 6 weeks after model establishment

注：A、B、C、D分別為超聲、T2WI、解剖、HE染色(× 200)結(jié)果。圖4 建模后8周，影像學(xué)與大體測量及病理對比Note. A-D: Results of ultrasound, T2WI, anatomical measurement, and H-E staining (×200), respectively.Figure 4 Imaging calculation, gross measurement, and pathological comparison of a tumor at 8 weeks after model establishment

3 討論

本研究顯示：瘤塊接種裸鼠肝，成瘤率80%，腫瘤均為單發(fā)結(jié)節(jié)、邊界清晰、包膜完整。肝原位癌建模方法有：肝、脾(瘤細胞通過脾靜脈、門靜脈入肝)癌細胞注射接種法、瘤組織塊肝接種法等[12]。后者與前兩者比較，操作稍復(fù)雜，耗時多，但重復(fù)性好[10]，潛伏期短、成瘤快。有報道[13]瘤塊接種肝2周后，形成0.5 cm腫瘤。而使用肝癌細胞(2×106)接種肝2周后，瘤結(jié)節(jié)僅0.1 cm。脾內(nèi)癌細胞(2×106)注射4周后，肝內(nèi)腫瘤也僅0.1 cm。Rao等[13]一次使用2～3個1 mm3的瘤塊植入裸鼠肝，2周后建模成功，直徑達0.5 cm。我們接種4周后，腫瘤直徑4 mm。他們成瘤比我們的快而大，考慮是因為一次植入了更多瘤組織。我們實驗中有3例未成瘤，可能原因是接種腫瘤時，瘤塊離體時間過長(最長時間48 min)，瘤塊缺血、癌細胞活性下降所致。

腫瘤影像學(xué)結(jié)果顯示：超聲4周時發(fā)現(xiàn)1例腫瘤，漏診3例，漏診原因分析：鼠肝為中等回聲，而腫瘤為稍低回聲(圖2～3)，腫瘤與正常肝回聲差別低，不易區(qū)分。其次，腫瘤直徑小，又受肝旁腹腔氣體干擾，故易漏診。本研究使用臨床檢查超聲儀，探頭頻率12 MHz，分辨率在mm級別。高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)探頭頻率30～60 MHz，分辨率達30 μm[14]，可更清晰顯示肝實質(zhì)回聲及更細微結(jié)構(gòu)，更準確評價腫瘤接種效果。我們未來也可使用該種儀器，進行更精細的研究。

T2相MRI檢查，腫瘤與正常肝組織信號強度差別明顯。T2WI(Philips 1.5 T)顯示，大鼠肝為低信號，原位肝癌結(jié)節(jié)呈高信號[9]。T2WI(Philips 1.5 T)裸鼠皮下肝癌模型為高信號，有輕微-中等強化[15]。我們研究發(fā)現(xiàn)，T2WI(Siemens 3.0 T臨床用儀器)配以特殊線圈(圖1)，裸鼠原位肝癌高信號(圖2～3)，正常鼠肝低信號，差別大，對比度高，腫瘤檢出率高，達100%。雖然7.0 T MRI較3.0 T MRI能夠提供更高圖像對比度和分辨率。但在更高的磁場強度掃查，受檢者需要忍受更多的不適感，如更大分貝噪音干擾、頭暈、眩暈、惡心、金屬味感等[16]。本研究使用臨床用MRI配以小動物線圈，獲得足夠圖像分辨率；且MRI測量腫瘤長徑與病理測量長徑比較，差異無顯著性。3.0 T臨床用MRI配以動物線圈是全程監(jiān)測裸鼠腫瘤生長的有效影像方法。

通過動態(tài)影像學(xué)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)鼠肝癌不斷生長，影像表現(xiàn)也不斷變化。瘤塊接種后4～6周，肝癌超聲表現(xiàn)為境界清晰的低回聲占位，內(nèi)部回聲均勻，無鈣化。同期MRI均勻高信號。病理顯示，癌細胞致密、實性、片狀、異型明顯。8周時超聲表現(xiàn)為實性不均質(zhì)低回聲，中心回聲增高，分布不均。同期MRI內(nèi)部信號雜亂，強弱不均。HE染色肝癌中心大片壞死。研究結(jié)果顯示：不同時期腫瘤的影像表現(xiàn)可以準確反映不同時期腫瘤的病理變化。4～6周時，肝腫瘤生長旺盛，是開始對腫瘤干預(yù)處理、進行治療的最佳時期。到第8周后，腫瘤中心有壞死，干預(yù)治療選擇時期可能太晚。

本研究局限性：影像學(xué)研究沒有在第5、7周進行，主要原因是MRI價格昂貴、費時費力，只是在間斷時期進行。其次，研究僅進行了超聲、MRI的常規(guī)檢查，沒有運用造影劑對腫瘤的血供狀況進行檢查，以后可以使用對比劑對腫瘤微血管進行更詳細研究。

總之，采用瘤塊接種法，裸鼠原位肝癌成瘤率高。MRI是全程監(jiān)測腫瘤生長的良好的影像學(xué)方法，影像學(xué)表現(xiàn)與病理存在相關(guān)性。1 mm3的腫瘤組織塊接種后4～6周，裸鼠肝原位癌腫瘤生長旺盛，是進行干預(yù)治療的最佳時期。