張 娜，郭慶啟，劉曉飛，關(guān)樺楠，郭長慧，Ikeda SHINYA，石彥國,*

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江省食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.上海廚業(yè)食品有限公司，上海 200126；4.美國威斯康星大學(xué)麥迪遜分校食品科學(xué)系，美國 威斯康星 麥迪遜 53705）

1989年，Rosenberg[1]首次將隨著年齡增加，肌肉質(zhì)量和功能逐漸衰減的現(xiàn)象命名為肌肉衰減癥（Sarcopenia）。我國人口日趨老齡化，預(yù)計2050年全球60 歲以上的人口將超過20億，而其中5億人口在中國[2]。經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，50 歲患肌肉衰減癥人群為1%～2%，70～75 歲患肌肉衰減癥人群大約為20%，80 歲以上患肌肉衰減癥人群則超過50%[3]。肌肉衰減癥患者會出現(xiàn)力量減弱，運動平衡能力下降，以及糖尿病、心臟病、骨質(zhì)疏松等癥狀。肌肉衰減癥的發(fā)病機制有許多，其中蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良是其主要原因之一，其次是缺乏運動，任何年齡不運動都會引發(fā)肌肉質(zhì)量和肌肉力量的減少[4-6]。

目前乳清蛋白以其亮氨酸、谷氨酰胺可增加肌肉細胞體積，抑制蛋白質(zhì)分解，促進肌肉生長，促進肌肉蛋白質(zhì)合成的作用而引起國內(nèi)外研究者們的關(guān)注[7]。同時，一些研究發(fā)現(xiàn)乳源酪蛋白、大米蛋白、大豆蛋白等膳食蛋白也富含亮氨酸，具有促進肌肉蛋白質(zhì)合成的作用[8-11]。亮氨酸被證明是肌肉蛋白質(zhì)合成環(huán)節(jié)中翻譯起始途徑中的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[12]。

酪蛋白非磷酸肽（casein non-phosphopeptide，CNPP）是堿性蛋白酶（Alcalase）水解酪蛋白，生產(chǎn)酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）過程中的副產(chǎn)物。CNPP是一系列重要生物活性肽的原材料，例如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽、免疫調(diào)節(jié)肽以及抗血栓肽，并對某些疾病起到防治的效果[13]。然而在生產(chǎn)CPP的過程中卻忽略了CNPP的營養(yǎng)價值，大量的CNPP均被當(dāng)作飼料或廢物棄去[14]。本研究通過檢測發(fā)現(xiàn)每100 g CNPP含有8.3 g亮氨酸，與文獻[8-9]中促進肌肉質(zhì)量增加的其他蛋白質(zhì)的亮氨酸含量相似，已有報道表明富含亮氨酸的肽或蛋白質(zhì)具有抑制肌肉衰減的作用[15-17]，且比單獨的亮氨酸更能有效促進肌肉質(zhì)量的增加[10]；因此本研究擬對CNPP抑制肌肉衰減的可能性及其增加肌肉質(zhì)量的能力進行表征。目前均以乳清蛋白作為改善肌肉衰減癥的研究對象[8,11]，而國內(nèi)的乳清蛋白均依靠進口，價格較貴[18]，選擇另一種富含亮氨酸、價格低廉且促進肌肉質(zhì)量增加的蛋白質(zhì)或肽十分必要，因而對CNPP增加肌肉質(zhì)量能力的探討具有實際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

雄性大鼠購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（吉）2016-0005。

Alcalase 美國Sigma公司；干酪素 北京奧博星有限公司；乳清蛋白 鄭州江大生物科技有限公司；動物飼料 長春億斯實驗動物技術(shù)有限公司；肝素鈉上海士鋒生物科技有限公司；乙醚 北京蒂華森科技有限公司；氫氧化鈉 天津市大陸化學(xué)試劑廠；無水乙醇 天津化學(xué)試劑有限公司；氯化鈣 天津市紅巖化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

LG10-2.4A離心分離機 北京京立離心機有限公司；XMTD-204恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；YC-015實驗型噴霧干燥機 上海比朗儀器有限公司；ALC-110-4電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-2F pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；Emotion-1型計算機斷層掃描（computed tomography，CT）儀 上海西門子醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 CNPP的制備

根據(jù)Adamson[19]和Zhao Li[20]等研究Alcalase水解酪蛋白制備CPP和CNPP的方法稍作修改。取適量酪蛋白緩慢加入適量蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為30～70 g/L，調(diào)節(jié)pH值至7.0～9.0，放在溫度為45～60 ℃水浴鍋中攪拌溶解。當(dāng)溶液pH值無明顯變化后，加入2 mol/L Alcalase，同時維持溶液pH 7.0～9.0，酶解4 h后，水解液于100 ℃沸水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫，加入1% CaCl2和體積分?jǐn)?shù)50%乙醇后，靜置1 h。水解液4 000 r/min離心10 min，沉淀于干燥箱中烘干并研磨成粉末即CPP。上清液收集、濃縮，并通過噴霧干燥技術(shù)制成粉末即CNPP[19-20]。

1.3.2 實驗分組

將80 只32 周齡雄性大鼠（體質(zhì)量350～380 g）置于（23±2）℃實驗室中自由攝入動物飼料并飲水，適應(yīng)7 d。將大鼠隨機分為飼喂CNPP組（樣品組）和乳清蛋白組（對照組），每組又分為抗阻力運動組和自由活動組。由于相關(guān)研究表明運動可以預(yù)防肌肉質(zhì)量的衰減，同時表明攝入營養(yǎng)協(xié)同抗阻力運動更易促進肌肉質(zhì)量的增加[4,9]，因此本研究設(shè)置飼喂CNPP的抗阻力運動組，與飼喂CNPP的自由活動組進行比較，主要目的是為了探討CNPP對大鼠肌肉質(zhì)量是否具有促進作用，以及CNPP協(xié)同抗阻力運動是否比沒有進行抗阻力運動且飼喂CNPP大鼠肌肉質(zhì)量的促進作用更加顯著。抗阻力運動組和自由活動組中的大鼠分別飼喂高（10.0 g/（kg·d））、中（5.0 g/（kg·d））、低（2.5 g/（kg·d））劑量CNPP或?qū)φ諛悠罚ㄈ榍宓鞍祝?，空白組的大鼠只飼喂普通動物飼料，不飼喂CNPP和對照樣品。每天上午8：00，分別取2 mL高、中、低劑量CNPP或乳清蛋白灌胃大鼠，空白組灌胃2 mL蒸餾水，灌胃后的大鼠可以自由采食動物飼料。

分別在第0、15、25、35、50天時，對抗阻力運動組和自由活動組中每只大鼠的軀干及下肢根部肌群、腰椎周圍肌群、背部肌群、肩胛內(nèi)側(cè)肌群、上肢左側(cè)根部肌群的肌肉橫截面積以及血液中胰島素、生長激素和睪酮水平進行測定。

1.3.3 抗阻力運動和自由活動訓(xùn)練

在踏步寬20 cm、高10 cm，10 節(jié)的臺階上進行抗阻力運動。將香腸抹在每節(jié)臺階上，使每節(jié)臺階只保留香腸的味道，并在最后的臺階上放0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的香腸引導(dǎo)大鼠爬樓梯。安排大鼠每天晚上17：00～18：00進行爬樓梯訓(xùn)練，每只大鼠進行3 組爬樓梯訓(xùn)練，爬10 節(jié)臺階為一組，每組訓(xùn)練結(jié)束后休息1 min，一周運動6 d。

自由活動組的大鼠除了在籠子里自由活動外，不做任何訓(xùn)練。

1.3.4 肌群橫截面積的測定

采用橫斷螺旋CT儀，根據(jù)解剖學(xué)特征，測定樣品組和對照組的大鼠在第0、15、25、35、50天時軀干及下肢根部肌群、腰椎周圍肌群、背部肌群、肩胛內(nèi)側(cè)肌群、上肢左側(cè)根部肌群的CT圖像。采用10%水合氯醛以腹腔注射的方式麻醉大鼠（麻醉劑量為0.3 mL/100 g mb），然后將其以俯臥的姿勢放在CT儀上進行掃描，掃描層厚設(shè)置0.5 cm。掃描得到的CT圖像，通過CT儀的軟件，用閉合曲線圈測定5 個肌群并計算得到肌群的橫截面積。肌群橫截面積增長量根據(jù)下式計算。

肌群橫截面積增長量/cm2＝Sn－S0

式中：Sn和S0分別為第n天和0 d時肌群的橫截面積/cm2。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行分析。通過單因素方差分析（One-way ANOVA）中最小顯著差異法進行顯著性分析，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。實驗設(shè)5 次重復(fù)，結(jié)果表示為±s。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗阻力運動組中飼喂高劑量CNPP或乳清蛋白的大鼠5 個肌群橫截面積的CT掃描結(jié)果比較

采用CT技術(shù)對大鼠肌肉質(zhì)量進行表征，其準(zhǔn)確度、空間分辨率、靈敏度、可重復(fù)性較高，圖像質(zhì)量清晰且無創(chuàng)傷、無危險[21-22]，更重要的是其可精確區(qū)分脂肪、骨骼、軟骨組織以及肌肉[23]。根據(jù)文獻[10]，本研究選擇5 個具有代表性的肌群進行檢測，不僅考察樣品對于動物不同肌群的效果，且對動物同一個肌群橫截面積的增長情況進行了重點研究。

為了觀察大鼠5 個肌群橫截面積的增長情況，對第50天時抗阻力運動組中飼喂高劑量CNPP或乳清蛋白的大鼠5 個肌群橫截面積的CT掃描圖，與0 d時檢測得到空白組大鼠的肌群橫截面積的CT掃描圖進行比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 抗阻力運動組中大鼠的5 個肌群橫截面積的CT掃描圖Fig.1 CT scanning of the cross-sectional area of five muscle groups of RE rats

根據(jù)圖1可以觀察到第50天抗阻力運動組中飼喂CNPP或乳清蛋白的大鼠5 個肌群的橫截面積均大于0 d時各肌群的橫截面積。除肩胛內(nèi)側(cè)肌群之外，其他4 組飼喂CNPP的大鼠的肌群橫截面積均大于乳清蛋白組?？梢猿醪脚袛啵a充CNPP或乳清蛋白并在抗阻力運動的協(xié)同下可以促進肌肉質(zhì)量的增加。為了更準(zhǔn)確表明大鼠肌肉增長情況，分別計算出第15、25、35、50天時每只大鼠的肌肉橫截面積增長量，如圖2、3所示。

2.2 飼喂CNPP時間對自由活動組大鼠5 個肌群橫截面積的影響

圖2 自由活動組中飼喂CNPP的大鼠的5 個肌群橫截面積增長量Fig.2 Increases in cross-sectional areas of five muscle groups from NE rats administered with CNPP

由圖2可知，自由活動組中飼喂CNPP大鼠的5 個肌群橫截面積增長量均隨著時間的延長而顯著增加（P＜0.05）。第50天時，自由活動組中飼喂高劑量或中劑量CNPP的大鼠的軀干及下肢根部肌群、背部肌群、肩胛內(nèi)側(cè)肌群和上肢左側(cè)根部肌群的橫截面積增長量顯著大于空白組（P＜0.05），且其中飼喂中劑量CNPP的大鼠的各肌肉橫截面積增長量較大，分別是空白組的1.19、1.16、1.24、1.93 倍。以上結(jié)果說明CNPP可以促進肌肉質(zhì)量的增加，這可能是由于CNPP富含亮氨酸（8.3 g/100 g），且其通過調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號傳導(dǎo)通路來促進蛋白質(zhì)的合成[24]。首先由亮氨酸促進磷脂酰肌醇3激酶或蛋白激酶B，使mTOR蛋白上某些位點的蘇氨酸和絲氨酸發(fā)生了磷酸化，進而活化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin 1，mTORC1）。mTORC1的活化將促使真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白和核糖體S6激酶發(fā)生磷酸化，真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白磷酸化后釋放了真核翻譯起始因子4E，促進了mRNA翻譯的起始，同時核糖體S6激酶發(fā)生磷酸化后促使核糖體蛋白S6磷酸化，促進了mRNA翻譯，從而調(diào)節(jié)肌肉蛋白質(zhì)的合成[25]。

2.3 飼喂不同劑量CNPP與乳清蛋白的大鼠肌群橫截面積的比較

由圖3A可知，在第50天時，自由活動組中飼喂高劑量或中劑量CNPP的大鼠的背部肌群、腰椎周圍肌群、上肢左側(cè)根部肌群的橫截面積增長量顯著大于乳清蛋白組（P＜0.05），其中飼喂低劑量CNPP的大鼠軀干及下肢根部肌群的橫截面積增長量與乳清蛋白相比增加了3.54 cm2。由圖3B可知，在第50天時，抗阻力運動組中CNPP各劑量組大鼠的軀干及下肢根部肌群、腰椎周圍肌群、背部肌群以及上肢左側(cè)根部肌群的橫截面積的增長量顯著大于乳清蛋白組（P＜0.05），其中飼喂低劑量CNPP的大鼠軀干及下肢根部肌群的橫截面積增長量較高，與乳清蛋白組相比增加了3.47 cm2。以上結(jié)果說明飼喂CNPP的自由活動組和抗阻力運動組大鼠中大部分肌群的橫截面積增長量顯著大于乳清蛋白組，因此可以認(rèn)為CNPP相對于乳清蛋白更易促進肌肉質(zhì)量的增加。其他研究結(jié)果也表明，除了乳清蛋白之外的其他蛋白質(zhì)具有較好的同乳清蛋白相似的促肌肉質(zhì)量增長的效果。Joy等[10]研究表明，分別給健康男性補充含有8.0 g/100 g亮氨酸的大米蛋白與富含11.5 g/100 g亮氨酸的乳清蛋白8 周后，兩組青年男性的瘦體質(zhì)量和肌肉質(zhì)量增加無顯著差異。Urbina等[26]分別給老年女性每日補充24 g酪蛋白和乳清蛋白，8 周后發(fā)現(xiàn)，補充酪蛋白和乳清蛋白組的脂肪減少量和瘦體質(zhì)量增加量無顯著差異。Babault等[27]給老年男性補充含9.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）亮氨酸的酪蛋白和12%亮氨酸的牛奶，10 周后發(fā)現(xiàn)兩組老年男性的右股外側(cè)肌厚度增加量無顯著差異。然而也有一些研究得到相反的結(jié)果，認(rèn)為乳清蛋白是促進肌肉質(zhì)量增加最有效的膳食蛋白，Norton等[8]探討補充乳清蛋白、大豆蛋白和小麥蛋白14 周對成年大鼠肌肉蛋白合成的影響發(fā)現(xiàn)，含有10.9%亮氨酸的乳清蛋白更有效地刺激肌肉蛋白的合成。Tang等[9]發(fā)現(xiàn)補充含有11.5%亮氨酸的乳清蛋白，青年男性的肌肉蛋白合成率顯著高于補充含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.0%亮氨酸的酪蛋白。

圖3 第50天時飼喂CNPP與乳清蛋白大鼠肌群橫截面積的增長量Fig.3 Increases in cross-sectional areas of the muscle groups in rats administered with CNPP or lactalbumin for 50 days

2.4 自由活動與抗阻力運動對飼喂同劑量CNPP大鼠肌群橫截面積的影響

圖4 第50天時抗阻力運動組中飼喂CNPP大鼠的肌群橫截面積增長量與相同劑量的自由活動組的比較Fig.4 Increase in cross-sectional areas of the muscle groups in RE and NE rats administered with CNPP for 50 days

由圖4發(fā)現(xiàn)，在50 d時抗阻力運動組飼喂高劑量CNPP的大鼠的軀干及下肢根部肌群、腰椎周圍肌群的橫截面積顯著大于自由活動組同劑量肌群橫截面積增長量（P＜0.05），抗阻力運動組飼喂低劑量和中劑量CNPP的大鼠的上肢左側(cè)根部肌群的橫截面積增長量顯著大于自由活動組同劑量肌群橫截面積增長量（P＜0.05），且飼喂高劑量CNPP的大鼠軀干及下肢根部肌群和腰椎周圍肌群與飼喂低劑量CNPP的大鼠的上肢左側(cè)根部肌群的橫截面積增長量較大，與自由活動組相同劑量肌群的橫截面積增長量相比，分別增加了1.27、0.45、0.17 cm2，綜合結(jié)果發(fā)現(xiàn)運動可以促進大鼠肌肉質(zhì)量的增加。運動之所以促進肌肉蛋白的合成，是因為抗阻力運動可以促進肌衛(wèi)星細胞含量增加或抑制肌衛(wèi)星細胞含量減少，從而抑制肌肉質(zhì)量的減少，延緩肌肉衰減[28]。又根據(jù)抗阻力運動組飼喂CNPP的大鼠的肌群橫截面積增長量大于自由活動組，推斷CNPP與抗阻力運動具有協(xié)同作用，可更好地促進肌肉質(zhì)量的增加。一些研究也表明，在補充豐富蛋白質(zhì)的條件下進行抗阻力運動可以促進肌肉蛋白的平衡。例如，Tipton等[29]發(fā)現(xiàn)，補充含8.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）亮氨酸的酪蛋白或含11.5%亮氨酸的乳清蛋白，與腿部伸展運動和舉重相結(jié)合，可以促進健康青年男性或女性肌肉蛋白的合成。Anthony等[30]通過給大鼠每天飼喂含8.2%亮氨酸的大豆蛋白或10.2%亮氨酸的乳清蛋白，且每天對其進行跑步機訓(xùn)練，8 周后發(fā)現(xiàn)大鼠肌肉蛋白合成率分別增加8.2%或8.3%。綜上可知，膳食蛋白質(zhì)協(xié)同抗阻力運動（抗阻力運動方式包括：啞鈴提踵、深蹲起、平板支撐、爬樓梯等）是促進肌肉質(zhì)量增加或抑制肌肉衰減的有效方法。

3 結(jié) 論

在自由活動條件下富含亮氨酸的CNPP可以刺激大鼠5 個肌群橫截面積增長量增加，且CNPP協(xié)同抗阻力運動更易促進大鼠肌肉質(zhì)量增加，本研究不僅為尋找一個新的抑制或改善肌肉衰減的食用肽提供參考，同時為拓寬CNPP的用途提供依據(jù)，CNPP無論是在經(jīng)濟還是應(yīng)用方面都有良好的發(fā)展前景。