，，

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是發(fā)生在老年期或老年前期的一種原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，以進(jìn)行性持續(xù)性學(xué)習(xí)記憶功能減退為主要臨床特征，以老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFT)、神經(jīng)元丟失為主要病理改變。現(xiàn)代研究證實(shí)，鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)及自由基生成過多是體內(nèi)一切細(xì)胞死亡的“共同通道”[1]。腦還丹是在具有抗衰老作用古方草還丹基礎(chǔ)上，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究，以骨碎補(bǔ)、熟地黃、石菖蒲等中藥組成的復(fù)方；既往研究表明，腦還丹能使AD病人的臨床癥狀得到明顯改善；可明顯提高去勢老齡大鼠血清胰島素樣生長因子水平[2]，穩(wěn)定去勢老齡大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，維持其突觸密度[3]，抑制快速老化鼠SAMP8腦內(nèi)過氧化反應(yīng)及神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的損傷，促進(jìn)抗凋亡基因bcl-x及海馬CA1區(qū)PSD-95、Shank-1蛋白的表達(dá)[4-5]。本研究以反映神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)為主要觀察指標(biāo)，以APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD模型，觀察腦還丹對其學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的影響，進(jìn)一步探討腦還丹改善學(xué)習(xí)記憶功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 3個(gè)月齡SPF級雄性APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠48只，同月齡、同遺傳背景、C57BL/6J小鼠12只，體重30 g±5 g，以上動物均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2013-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥 腦還丹由人參、熟地黃、骨碎補(bǔ)等組成，采用顆粒劑(廣東一方制藥有限公司提供，批號312046T)，鹽酸多奈哌齊片[商品名：安理申，規(guī)格：每片5 mg，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司提供，批號130437B]，實(shí)驗(yàn)時(shí)均按照需要，用蒸餾水配制成所含生藥量不同濃度的藥液。

1.3 主要試劑及儀器 YLS-Q6小鼠灌胃器[安合盟(天津)科技發(fā)展有限公司]，Morris水迷宮(由中山大學(xué)解剖教研室提供)，F(xiàn)luo-4/AM熒光探針[東仁化學(xué)科技(上海)有限公司]，超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠)，BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(碧迪醫(yī)療器械有限公司)。其他如雙蒸水、胰酶、水合氯醛、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組 將上述48只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為模型組、腦還丹低劑量組、腦還丹高劑量組及多奈哌齊組，每組12只；另選取C57BL/6J小鼠12只作為正常對照組。

1.4.2 藥物配制及給藥 腦還丹及多奈哌齊用藥劑量按動物體表面積比率等劑量法換算[6]，以成人(體重60 kg為參考)常規(guī)劑量折算為小鼠的基礎(chǔ)劑量，常規(guī)劑量2倍作為高劑量。用雙蒸水將腦還丹顆粒沖劑配制成濃度為1 g/mL和0.5 g/mL藥液，鹽酸多奈哌齊配制成濃度為0.24 mg/mL藥液，冷藏保存，使用時(shí)加至常溫并攪拌均勻。按以下劑量對給藥組小鼠進(jìn)行灌胃：腦還丹高劑量組41.6 g/(kg·d)，腦還丹低劑量組20.8 g/(kg·d)，多奈哌齊組8.0 mg/(kg·d)。正常對照組、模型組小鼠每日灌以等量蒸餾水。每日1次，持續(xù)4個(gè)月。

1.4.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 采用由中國科學(xué)院研制Morris水迷宮(中山大學(xué)北校區(qū)解剖教研室)進(jìn)行行為學(xué)測試[7]，包括隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)5 d及空間探索實(shí)驗(yàn)1 d。以此評價(jià)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及多奈哌齊和腦還丹對其影響。

1.4.4 標(biāo)本采集 Morris水迷宮測試結(jié)束后，每組取8只小鼠斷頭處死，無菌條件下剝出全腦，沿大腦縱裂切開，并用玻璃棒分離出海馬組織，放入凍存管立即置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆茫糜诩?xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的檢測。海馬區(qū)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i檢測：①將海馬組織置于生理鹽水中進(jìn)行機(jī)械剪切，之后添加胰酶進(jìn)行消化，制備單細(xì)胞懸液，加入終濃度為4 μmol/L的Fluo-4/AM熒光探針，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育20 min后除去Fluo-4/AM工作液；用PBS溶液洗滌細(xì)胞3次，之后加入PBS重懸細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱孵育約30 min后加入PBS液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為1×105/mL，以流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i。②結(jié)果統(tǒng)計(jì)：以發(fā)射波長為516 nm，激發(fā)波長為488 nm條件下使用流式細(xì)胞儀檢測到的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度作為統(tǒng)計(jì)值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 定位航行實(shí)驗(yàn)的觀察主要包括小鼠找到平臺的時(shí)間(潛伏期)和搜索路線。隨著觀察時(shí)間延長，模型組小鼠潛伏期明顯長于正常對照組(P<0.01)；從第3天開始，腦還丹高劑量組低劑量組及多奈哌齊組潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.01)，與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組和多奈哌齊組找到平臺所用時(shí)間明顯縮短(P<0.05)；多奈哌齊組與腦還丹高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1、圖2、表1。

圖1 正常對照組與模型組小鼠逃避潛伏期比較

圖2 腦還丹低劑量組、高劑量組、多奈哌齊組及模型組小鼠逃避潛伏期比較

表1 各組小鼠隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s) s

搜索平臺路線方面，隨著時(shí)間增加，各組小鼠采取邊緣式、隨機(jī)式探索次數(shù)逐漸減少，而趨向式、直線式探索路線次數(shù)逐漸增加。從第2天開始，正常對照組趨向式、直線式探索路線次數(shù)較其他4組明顯增加。第4天、第5天腦還丹低劑量組、高劑量組及多奈哌齊組采取直線式、趨向式路線次數(shù)明顯多于模型組。詳見圖3。

A：正常對照組；B：模型組；C：腦還丹低劑量組；D：腦還丹高劑量組；E：多奈哌齊組

2.2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 平臺撤去后，第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。記錄小鼠在平臺象限內(nèi)停留時(shí)間，以測試小鼠對平臺的空間記憶能力。正常對照組、腦還丹低劑量組、高劑量組和多奈哌齊組平臺象限停留時(shí)間較模型組顯著延長(P<0.01)；且腦還丹高劑量組、多奈哌齊組較低劑量組平臺象限內(nèi)停留時(shí)間明顯延長(P<0.05)；正常對照組、腦還丹低劑量組、高劑量組和多奈哌齊組首次跨越平臺時(shí)間較模型組縮短(P<0.05或P<0.01)，且腦還丹高劑量組、多奈哌齊組較腦還丹低劑量組縮短(P<0.05)。與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組小鼠在定位航行中所用時(shí)間較少，平臺象限內(nèi)停留時(shí)間較長(P<0.05)。詳見表2。

2.3 各組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i比較 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示(見圖4)，5組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.86，P<0.05)；與模型組比較，各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度明顯減少(P<0.01)；與腦還丹低劑量組比較，腦還丹高劑量組[Ca2+]i明顯減少(P<0.01)；多奈哌齊組與腦還丹高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖5、表3。

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較(±s) s

圖4 各組小鼠海馬細(xì)胞[Ca2+]i比較

與模型組比較，*P<0.05，#P<0.01

表3 各組小鼠海馬細(xì)胞[Ca2+]i比較(±s) nmol/L

3 討 論

有研究表明，在AD發(fā)生發(fā)展過程中伴有鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)。正常情況下鈣離子在細(xì)胞內(nèi)外分布受細(xì)胞膜和質(zhì)膜的屏障作用及細(xì)胞膜鈣通道調(diào)節(jié)。Ca2+通道是鑲嵌膜上有孔道的蛋白質(zhì)，其對鈣離子的通透性受電壓、受體及胞內(nèi)鈣量等調(diào)控。生理?xiàng)l件下，由于質(zhì)膜上和胞膜上Ca2+-ATP酶(鈣泵)的存在，細(xì)胞內(nèi)鈣離子保持低濃度狀態(tài)，僅為細(xì)胞外的1/20 000。作為細(xì)胞內(nèi)第二信使，鈣離子參與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育分化、遞質(zhì)的釋放、突觸的傳遞、激素的放大效應(yīng)、酶的激活等多種生理過程。質(zhì)膜受損或鈣泵供能障礙，可發(fā)生鈣離子內(nèi)流，引起鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)而導(dǎo)致鈣超載的發(fā)生；細(xì)胞內(nèi)過多的游離Ca2+可激活Ca2+調(diào)節(jié)的核酸內(nèi)切酶、CaM等多種酶，進(jìn)而引起一系列基因、蛋白的表達(dá)異常，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至死亡[8]。在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中Aβ及活性氧自由基通過引起神經(jīng)元鈣超載而產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的。Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)導(dǎo)致的鈣超載在AD發(fā)病過程中的作用已經(jīng)得到人們的重視。已有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，通過減少細(xì)胞內(nèi)的[Ca2+]i可有效改善癡呆動物模型的學(xué)習(xí)記憶功能[9]。

APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠是以APP單轉(zhuǎn)基因小鼠與PS1單轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行雜交，或運(yùn)用DNA重組技術(shù)將APP和PS1兩種外源突變基因同時(shí)傳染、整合到小鼠的基因組中而得到。實(shí)驗(yàn)研究表明，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠在4.5月齡時(shí)，大腦皮層即出現(xiàn)淀粉樣沉積和SP，且隨著月齡增加，大腦皮層SP數(shù)量面積明顯增大[10]；至9月～12月齡時(shí)，可出現(xiàn)與AD病人相似的SP[11]。行為學(xué)方面研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月齡時(shí)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠已出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。這一結(jié)果表明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)與AD病人相似的發(fā)病進(jìn)程，是研究AD較理想的動物模型。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較多奈哌齊組和腦還丹干預(yù)組小鼠在隱蔽平臺試驗(yàn)中所用時(shí)間明顯縮短，而空間探索試驗(yàn)中在原平臺象限停留時(shí)間明顯增加，提示腦還丹、多奈哌齊均可明顯改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能。海馬區(qū)[Ca2+]i檢測提示，模型組較正常對照組海馬細(xì)胞[Ca2+]i明顯增高(P<0.01)；腦還丹干預(yù)組及多奈哌齊組[Ca2+]i較模型組明顯降低(P<0.01)。

鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)與學(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)系推斷可能有以下幾方面原因：①機(jī)體老化時(shí)伴隨全身臟器、組織和細(xì)胞的老化；②機(jī)體老化只是外在表象，其實(shí)質(zhì)是細(xì)胞生物膜的受損；③細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致各離子通道的功能異常，其中Ca2+通道所受影響尤為明顯，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流增加，使Ca2+在胞內(nèi)聚積，激活細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體鈣庫釋放，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度進(jìn)一步升高，加劇細(xì)胞老化；④細(xì)胞老化，導(dǎo)致線粒體功能障礙，細(xì)胞供能障礙，鈣泵失常，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+潴留；⑤細(xì)胞老化與Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，形成惡性循環(huán)，進(jìn)而導(dǎo)致突觸丟失、細(xì)胞凋亡等一系列病理變化，導(dǎo)致APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。這可能是APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯低于C57BL/6J小鼠的原因之一，而腦還丹和多奈哌齊可通過穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，減輕下游的細(xì)胞功能損害，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能，進(jìn)而改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

綜上所述，腦還丹可顯著改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與其穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i，降低Ca2+超載，減少自由基產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞生物膜有關(guān)。腦還丹高劑量組療效優(yōu)于低劑量組的原因可能為藥物有效成分含量較高，增加血藥濃度，改善學(xué)習(xí)記憶功能。