張夢琦 何云霞 高詩雅 鄧宇亭 李崗 陳冬梅

[摘要] 目的 檢測NCX1基因在大氣混合污染物處理下的高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）心肌中的表達情況，探討大氣混合污染物對肥厚型心肌病的分子影響機制。 方法 選取80只SHR大鼠隨機分為對照組及低、中、高劑量組，分別以1 d、7 d、30 d、60 d、90 d五個時間點進行檢測。大鼠染塵每周1次，染毒每天連續(xù)進行3.5 h；對照組氣管灌注生理鹽水，正常呼吸。建模完成后，殺鼠取近左心室處心肌組織提取總RNA，利用實時熒光定量PCR檢測NCX1基因表達量。 結(jié)果 SHR大鼠低中高劑量組中NCX1基因在不同時間段均為高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著處理劑量的增高，NCX1基因相對表達量發(fā)生明顯變化的時間提前。 結(jié)論 大氣混合污染物可能是通過使NCX1基因表達上調(diào)，增加胞內(nèi)鈣離子的濃度，使心肌收縮功能發(fā)生改變，進而參與肥厚型心肌病的發(fā)生與發(fā)展。

[關(guān)鍵詞] 大氣混合污染物；肥厚型心肌?。籒CX1；實時熒光定量PCR

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）21-0030-04

[Abstract] Objective To detect the expression of NCX1 gene in myocardium of spontaneously hypertensive rats（SHR） treated with atmospheric mixed contaminants and to explore the molecular mechanism of atmospheric mixed contaminants on hypertrophic cardiomyopathy. Methods Eighty SHR rats were randomly divided into control group， low， middle and high dose groups， and were detected at five time points： 1 d， 7 d， 30 d， 60 d， and 90 d. Rats were exposed to dust once a week for 3.5 hours per day. Controls were given tracheal infusion of normal saline and normal breathing. After the modeling was completed， the total RNA extracted from the left ventricle was extracted from the left ventricle and the expression of NCX1 gene was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The expression of NCX1 gene in the low， medium， high dose SHR group was significantly higher than that in the control group（P<0.05）. With the increase of treatment dose， the time for significant changes in the relative expression of NCX1 gene was advanced. Conclusion The airborne mixed pollutants may be involved in the occurrence and development of hypertrophic cardiomyopathy by up-regulating the expression of NCX1 gene， increasing the concentration of intracellular calcium and increasing the contractile function of the heart muscle.

[Key words] Atmospheric mixed pollutant； Hypertrophic cardiomyopathy； NCX1； Real-time fluorescence quantitative PCR

肥厚型心肌病（hypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種常染色體顯性遺傳性心肌病，典型解剖學(xué)特點是心室不對稱性肥厚、心腔變小，組織學(xué)改變主要包括心肌細胞排列紊亂、小血管病變及瘢痕形成。該病的發(fā)病率約為200/10萬，是青少年和運動員心源性猝死的最主要原因之一。HCM具有遺傳異質(zhì)性，預(yù)后差異很大，多數(shù)患者癥狀輕微，預(yù)期壽命可以接近常人。HCM是致病基因、修飾基因和環(huán)境因素等共同作用的結(jié)果。

大氣混合污染物包括氣態(tài)污染物和氣溶膠污染物，前者主要有SO2、NO2和CO，后者常被稱為大氣顆粒物（particulate matter，PM），是空氣污染中對人體健康最不利的因素?？諝鈩恿W(xué)直徑≤2.5 μm的大氣懸浮顆粒物稱作PM2.5，亦稱細粒子或細顆粒物，主要來自于煤和生物燃料（木材、木炭、動物糞便和農(nóng)作物廢料）的燃燒[1]、工業(yè)活動和市區(qū)汽車尾氣排放[2]。2010 年5月，AHA指出大氣PM2.5暴露與心血管疾病發(fā)病率和死亡率存在明確的因果關(guān)系。NCX1基因位于HCM代謝通路中，其表達量的上調(diào)或下調(diào)可能對HCM的發(fā)生和發(fā)展具有影響。

目前較少見關(guān)于大氣PM2.5暴露與肥厚型心肌病之間關(guān)聯(lián)的報導(dǎo)。本實驗利用實時熒光定量PCR的方法，檢測不同濃度大氣混合污染物在不同時間處理下的SHR大鼠心肌NCX1基因表達量，來探討心肌組織在轉(zhuǎn)錄水平對大氣混合污染物處理的響應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗對象為80只SHR大鼠（雌雄各半，體重180±20 g，10周齡），由北京維通利華實驗動物公司提供，許可證號：SCXK（Beijing）2012-0001。根據(jù)隨機數(shù)字表采取隨機數(shù)分組法進行分組。SHR大鼠飼養(yǎng)溫度為（22±2）℃，濕度為45%～55%，自然晝夜，自然光照，自由飲水及取食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，觀察其活動與進食是否正常。將大鼠稱量體重后，按隨機數(shù)表分為四組：對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。每個劑量組分別在1 d、7 d、30 d、60 d、90 d進行取材。

1.2 主要儀器和試劑

120F型大流量的粉塵采樣器、HOPE-MED8050F液氣類動態(tài)染毒系統(tǒng)、恒溫超聲振蕩器、精密電子天平、全自動高壓蒸氣消毒鍋、-80℃超低溫冰箱、超凈工作臺、低溫離心機，熒光定量PCR儀，電泳儀。RNA提取試劑盒[江蘇溥搏生物科技有限公司（Probegene） MM032]，Nuclease-Free Water（Probegene），Chloroform、Isopropyl alcohol、Ethanol（國藥），第一鏈 cDNA Synthesis Kit（Probegene MM061），2xSYBR Green qPCRMaster mix（Probegene MQ051）。

1.3 PM2.5混懸液的制備

以120F型大流量粉塵采樣器進行PM2.5收集（采樣流量：1000 L/min），采樣地點遼寧省沈陽市交通要道。采集的含塵濾膜于-20℃保存。將含塵濾膜剪成2×2 cm2的大小，浸泡于超純水中，超聲震蕩儀洗脫，六層紗布過濾后于低溫超速離心機中離心（1000 r/min，4℃），收集底層顆粒物，冷凍后真空干燥，-80℃保存。生理鹽水定容后配制PM2.5懸浮液。

1.4 混合氣體的制備

SO2、NO2、CO的標準混合氣體由大連特種氣體產(chǎn)業(yè)公司提供，鋼瓶內(nèi)填充壓力均為9.0 MPa，體積均為40 L。低濃度組（SO2：40.7×10-6，NO2：24.0×10-6，CO：469.2×10-6）；中濃度組（SO2：405.9×10-6，NO2：239.0×10-6，CO：4678.1×10-6）；高濃度組（SO2：2013.1×10-6，NO2：1187.0×10-6，CO：23199.6×10-6）。

1.5 引物設(shè)計

引物由上海生工合成，序列如下：

NCX1-F GCCATAACTTCACCGCAGGG

NCX1-R CTTCCCAGACCTCCACGACA

1.6 實驗方法

1.6.1 實驗?zāi)Ｐ偷慕?染塵：采用非暴露式氣管灌注方式進行染塵，每周1次，每次1 mL，對照組注入等體積生理鹽水。PM2.5混懸液低、中、高劑量濃度分別為：雄鼠：0.04 mg/mL、0.4 mg/mL及4 mg/mL，雌鼠：0.03 mg/mL、0.3 mg/mL及3 mg/mL，注入的粉塵顆粒物量分別相當(dāng)于國家環(huán)境質(zhì)量二級標準的1倍、10倍、100倍。染毒：動態(tài)染毒系統(tǒng)中進行，每天連續(xù)染毒3.5 h。對照組呼吸正常空氣。

1.6.2 心肌標本的采集 心臟全部取出，橫截切取近左心室處，大約100 mg放入去酶EP管中，加入RNA保存液1 mL，完全浸入，4℃冰箱過夜，再置于-80℃低溫冰箱保存。

1.6.3 實時熒光定量PCR（Real-time PCR） （1）總RNA的提?。河肨Rizol試劑提取心肌組織中的總RNA，并對RNA的完整性和純度進行檢測。（2）cDNA反轉(zhuǎn)錄及產(chǎn)物保存：以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Oligo（dT）15（50 μM）1.25 μL，模板RNA（總RNA）：2 μg，dNTPs（10 mM，each）2.5 μL，RTEnzyme Mix 2.5 μL，5×RT Buffer 10 μL，加RNase free ddH2O至50 μL。反應(yīng)條件：50℃～55℃ 60 min，85℃ 5 min。將得到的cDNA（目的基因）在-20℃保存?zhèn)溆?。?）Real-time PCR：選用GAPDH為內(nèi)參，引物設(shè)計由Probegene完成設(shè)計，上海生工合成。目的基因為NCX1，內(nèi)參基因為GAPDH，以cDNA為模板進行復(fù)制，熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：2xSYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，Primer 1（100 μM）0.08～0.2 μL，Primer 2（100 μM），模板DNA 0.2～0.5 μL，加ddH2O至10 μL。熒光定量 PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性2 min，94℃ 20 s，55℃ 30 s，68℃ 60 s，40個循環(huán)。

在反應(yīng)結(jié)束時，觀察PCR反應(yīng)的溶解曲線，判斷有無非特異性擴增及引物二聚體的產(chǎn)生；觀察擴增曲線確定其熒光閾值（Ct值），運用相對定量（2-ΔΔt法）的方法計算 NCX1基因相對表達量。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進行整理。計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 總RNA完整性檢測

用瓊脂糖凝膠電泳（電泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE緩沖液；150v，15 min）檢測RNA的完整性（封三圖2），結(jié)果顯示RNA完整、未被污染和降解。RNA OD260/280值符合RNA實驗要求。

2.2熒光定量PCR檢測結(jié)果

溶解曲線（封三圖3）示全部為單峰，表示無引物二聚體的產(chǎn)生和非特異性擴增，擴增產(chǎn)物是一種物質(zhì)。擴增曲線（封三圖4）所示，所有的產(chǎn)物都進入擴增期，反應(yīng)條件的設(shè)定準確。

2.3 各劑量組中NCX1基因的相對表達量情況

SHR大鼠低中高劑量組中NCX1基因在不同時間段均為高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著處理劑量的增高，NCX1基因相對表達量發(fā)生明顯變化的時間提前。在各劑量（低、中、高）組中，大氣混合污染物處理下的1 d組NCX1基因相對表達量分別與7 d、30 d、60 d、90 d組進行兩兩比較。低劑量組中，1 d組NCX1基因相對表達量為（1.948±0.058），90 d組NCX1基因相對表達量為（2.107±0.061），1 d組NCX1基因表達低于90d組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而1 d與7 d、30 d、60 d組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中劑量組中，1 d組NCX1基因相對表達量為（1.764±0.089），30 d和60 d組NCX1基因相對表達量分別為（2.177±0.131）、（2.087±0.050），1 d組NCX1基因表達量低于30 d、60 d組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與30 d組的差異更大，與7 d、90 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在高劑量組中，1 d組NCX1基因相對表達量（1.714±0.043）與7 d（2.039±0.061）、30 d（2.009±0.029）、60 d（2.114±0.063）、90 d（1.964±0.074）組NCX1基因相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。相對于低劑量組，中劑量組在30 d就出現(xiàn)了有統(tǒng)計學(xué)意義的差異；而在高劑量組，這種變化尤為明顯，于第7天即開始出現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。見表1。

3討論

NCX1即Na+/Ca2+交換蛋白，主要在心肌組織被表達，是心肌細胞膜鈣轉(zhuǎn)運蛋白之一[3]，在跨膜鈉鈣梯度和膜電位的驅(qū)動下對細胞內(nèi)外Na+、Ca2+進行雙向轉(zhuǎn)運，交換比例為3Na+：1Ca2+[4]。正常生理條件下，NCX1以正向轉(zhuǎn)運的方式外排Ca2+，與肌漿網(wǎng)和細胞膜上的鈣泵共同維持細胞靜息狀態(tài)時的低鈣濃度。病理條件下，NCX1則以反向轉(zhuǎn)運的方式外排Na+，細胞外的Ca2+進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超載。NCX1的mRNA和蛋白水平變化與慢性心力衰竭、糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注損傷、心律失常等心血管疾病有關(guān)[5-7]。相關(guān)研究表明，心律失常和心衰患者以及肥厚心肌中出現(xiàn)NCX1的表達量增高[8-10]。

PM2.5粒徑小，可直接進入并沉積于肺泡，甚至通過呼吸道屏障進入血液循環(huán)，順血流侵犯全身各靶器官，造成多種組織器官的損害；又因其表面攜帶大量的有害物質(zhì)，且能較長時間停留在空氣中[11]，故PM2.5相對于PM10危害更大。PM2.5是現(xiàn)代心血管疾病高發(fā)的誘因之一。目前，關(guān)于PM2.5對心血管系統(tǒng)疾病的影響主要涉及流行病學(xué)方面的研究。大量研究表明，短期暴露于PM2.5即可導(dǎo)致心血管疾病死亡率增加，PM2.5每升高10 μg/m3，死亡率增加1.03%[12]。Brook等[13]對相關(guān)研究的匯總結(jié)果顯示，長期暴露下，PM2.5每增加10 μg/m3，心血管死亡率增加 3%～76%。目前關(guān)于PM2.5對心血管疾病的具體機制并不十分清楚。相關(guān)研究表明，大氣PM2.5主要通過對心血管系統(tǒng)的直接毒性和間接的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)兩方面導(dǎo)致心血管系統(tǒng)疾病[14-16]。PM2.5可以增加人體循環(huán)系統(tǒng)中的IL-6、TNF-α及CRP等炎癥因子，導(dǎo)致急性血管收縮、心肌缺血和血液凝固以及降低斑塊穩(wěn)定性，增加急性心血管事件的發(fā)生。PM2.5可導(dǎo)致血管平滑肌增生，后者與各種心血管疾病的發(fā)生相關(guān)。PM2.5產(chǎn)生的活性氧（ROS），可對循環(huán)系統(tǒng)產(chǎn)生氧化損傷。吸入PM2.5會使血壓升高，斑塊穩(wěn)定性降低、室性心律失常和血栓形成過程的風(fēng)險增加等。

本實驗運用非特異性熒光標記，相對定量的方法對NCX1基因表達量進行分析，具有簡單、經(jīng)濟和準確的優(yōu)點。熒光定量的結(jié)果顯示溶解曲線均為單峰，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體，說明定量準確，結(jié)果可靠。

本實驗實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：在低中高各劑量及不同的時間段中，大氣混合污染物使SHR大鼠NCX1基因的相對表達量都增加，提示大氣混合污染物可能是通過使NCX1基因表達上調(diào)，影響胞內(nèi)鈣離子的濃度，使心肌收縮功能發(fā)生改變，進而參與肥厚型心肌病形成的相關(guān)機制中。低劑量組在90 d NCX1基因相對表達量出現(xiàn)明顯差異而中劑量組在30 d出現(xiàn)了有統(tǒng)計學(xué)意義的差異，相對于低劑量時NCX1基因相對表達量發(fā)生明顯變化的時間提前。而在高劑量組，這種變化尤為明顯，于第7天即開始出現(xiàn)明顯變化。這些說明機體對于低濃度的大氣混合污染物在較長時間內(nèi)都有一定的代償作用；對于較高濃度的大氣混合污染物只在短時間內(nèi)有代償作用，于長期大氣混合污染物暴露下機體會失代償；當(dāng)機體暴露于高濃度的大氣混合污染物時，短期內(nèi)就會失代償。

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（收稿日期：2018-03-30）