戴玲瑛，齊曼婷，王立梅，齊 斌,*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.譜尼測試集團(tuán)江蘇有限公司，江蘇 蘇州 215000；

3.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，蘇州市食品生物技術(shù)重點實驗室，發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500）

蝦醬又名蝦膏，全國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會將其定義為“毛蝦等小型蝦類經(jīng)腌制、搗碎、發(fā)酵制成的糊狀食品”[1]，是我國及東南亞地區(qū)的常用的調(diào)味料之一[2]。蝦醬主要包括對蝦醬、白蝦醬和麻線醬。捕撈后的麻線蝦去雜、加鹽，自然發(fā)酵1 個月后即可制成麻蝦醬。蝦醬中含有豐富的蛋白質(zhì)、鈣、類胡蘿片素和幾丁質(zhì)[3-4]，具有抗氧化活性[5]、降膽固醇、降血壓及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等生物功能活性[6]，在功能性食品領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用空間。目前為止，對于蝦醬的微生物群落組成及結(jié)構(gòu)的研究極少，因此，開展蝦醬中微生物群落多樣性的研究具有重要意義。

高通量測序技術(shù)可對數(shù)百萬個DNA分子同時測序，對物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致而全面的分析[7]。由于其具有高讀長、高精度、高通量、無偏性等優(yōu)勢[8]，現(xiàn)已被廣泛用于對許多發(fā)酵食品的微生物群體結(jié)構(gòu)分析，如汾酒、奶酪、開菲爾谷粒等[9-12]。自然發(fā)酵的海產(chǎn)品通常會有來自原料以及與海產(chǎn)品的生長環(huán)境相關(guān)的微生物[13]，而細(xì)菌是海產(chǎn)品發(fā)酵的主要微生物，所以對海產(chǎn)品的細(xì)菌微生物多樣性進(jìn)行研究很有必要。目前，海洋多樣性的研究是眾多學(xué)者研究的熱點[14]，針對于蝦的微生物多樣性研究也大多集中在蝦本身以及蝦的養(yǎng)殖環(huán)境[15-17]，但對于用蝦作為原料制成的蝦醬的研究少之又少。因此，利用高通量測序技術(shù)對蝦醬中微生物的多樣性及組成進(jìn)行研究十分重要，可更好地保證生產(chǎn)出安全健康的蝦醬產(chǎn)品。

本研究的目的是利用高通量測序方法對蝦醬中間產(chǎn)物的細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，更全面地呈現(xiàn)出蝦醬中微生物的多樣性，剖析各類微生物的結(jié)構(gòu)比例，明確優(yōu)勢菌群，了解優(yōu)勢菌群在蝦醬中可能產(chǎn)生的影響，以此更好地保證蝦醬的安全與衛(wèi)生，提高蝦醬品質(zhì)，完善蝦醬的生產(chǎn)過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦醬（未經(jīng)過滅菌處理）由連云港市海娃食品有限公司提供。

E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 美國OMEGA公司；Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司；Taq DNA Polymerase 美國Thermo公司；Agencourt AMPure XP 美國Beckman公司。

1.2 儀器與設(shè)備

臺式離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；旋渦混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司；混勻型干式恒溫器深圳拓能達(dá)科技有限公司；電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司；Qubit?2.0熒光計美國Invitrogen公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；移液器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)分析

水分的測定：按照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》，采用直接干燥法；灰分的測定：按照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》，采用加助灰化劑法；蛋白質(zhì)的測定：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法；脂肪的測定：按照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》，采用酸水解法；亞硝酸鹽的測定：按照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》，采用分光光度法；揮發(fā)性鹽基氮的測定：按照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》，采用半微量定氮法；氨基酸態(tài)氮的測定：按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，采用酸度計法；食鹽的測定：按照GB/T 5009.39—2003《醬油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，采用直接滴定法；礦物元素的測定：蝦醬經(jīng)微波消解后[18]進(jìn)行等離子體原子發(fā)射光譜儀檢測。

1.3.2 微生物指標(biāo)分析

菌落總數(shù)：按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進(jìn)行測定；大腸菌群：按照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》進(jìn)行測定；沙門氏菌：按照GB 4789.4—2016《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》進(jìn)行測定；志賀氏菌：按照GB 4789.5—2016《食品微生物學(xué)檢驗 志賀氏菌檢驗》進(jìn)行測定；金黃色葡萄球菌：按照GB 4789.10—2016《食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》進(jìn)行測定；單核細(xì)胞增生李斯特氏菌：按照GB 4789.30—2016《食品微生物學(xué)檢驗 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》進(jìn)行測定；致病性弧菌：按照SN/T 2564—2010《水產(chǎn)品中致病性弧菌檢測》進(jìn)行測定。

1.3.3 微生物多樣性分析

1.3.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒對蝦醬樣品的細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行提取，并用瓊脂糖凝膠檢測DNA的完整性。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量以確保分離得到足夠量的高質(zhì)量基因組DNA。

將提取到的基因組D N A對細(xì)菌1 6 S r D N A的V3-V4區(qū)域進(jìn)行兩輪P C R擴(kuò)增。第1輪擴(kuò)增以3 4 1 F（C C T A C G G G N G G C W G C A G）和8 0 5 R（GACTACHVGGGTATCTAATCC）為引物。94 ℃預(yù)變性3 min，首先以94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s為5個循環(huán)；接著進(jìn)行20個循環(huán)的94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸5 min。第2輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物，95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，5個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后配制1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.3.3.2 測序數(shù)據(jù)的處理優(yōu)化

為得到準(zhǔn)確有效的數(shù)據(jù)，運用Qiime（version 1.8.0）軟件對序列進(jìn)行過濾，標(biāo)準(zhǔn)為：去除3’端的引物接頭；去除引物錯配比率大于0.1的序列；去除樣本中序列尾部質(zhì)量值小于20的堿基；去除含N的序列；去除長度小于200 bp的序列；去除嵌合體序列，運用Mothur（version 1.30.1）軟件中Uchime的方法去除嵌合體序列，保證信息分析質(zhì)量，得到優(yōu)質(zhì)序列。

1.3.3.3 多樣性分析

利用Usearch（version 5.2.236）軟件對97%的相似水平下的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進(jìn)行聚類分析，選擇豐度最高的序列作為OTU代表性序列。

利用Mothur（version 1.30.1）軟件，可計算出群落分布豐度指數(shù)Chao指數(shù)和ACE指數(shù)以及群落分布多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)。

1.3.3.4 群落結(jié)構(gòu)分析

利用BLAST將OTU序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩選出OTU序列最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾，去除相似度小于10%且Coverage小于10%的序列，數(shù)據(jù)庫為：http://ncbi.nlm.nih.gov/。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可得到樣品在不同分類水平上（門、綱、目、科、屬）的分類學(xué)比對情況，主要包括：樣品中含有何種微生物；樣品中微生物的相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦醬的理化及微生物指標(biāo)分析

表1 蝦醬的物理化學(xué)及微生物指標(biāo)Table 1 Physicochemical and microbiological parameters of shrimp sauce

由表1可知，蝦醬中含有7.924%的蛋白質(zhì)和12.775 mg/L的Ca元素，說明本實驗原料中含有豐富的人體所必須的蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分。另外，蝦殼中的不溶性鈣在經(jīng)過發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的乳酸和醋酸等有機(jī)酸作用后可形成大量的可溶性鈣更有利于人體的吸收[19]。蝦醬中的揮發(fā)性鹽基氮和氨基酸態(tài)氮分別為4.233 mg/100 g和0.361%，符合國家衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)。蝦醬發(fā)酵過程中，硝酸鹽在微生物和酶的作用下產(chǎn)生亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是一種致癌性物質(zhì)[20]，本實驗中蝦醬的亞硝酸鹽含量為0.530 mg/kg，遠(yuǎn)低于國際醬腌菜衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/kg）。揮發(fā)性鹽基氮反映了水產(chǎn)品原料的新鮮度[21]，本實驗中蝦醬的揮發(fā)性鹽基氮含量較低，表明食品新鮮度很高，可以安全食用。張德友[22]采用低鹽技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)的蝦醬，食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%～18%，而本實驗中蝦醬的食鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.254%，更符合發(fā)酵食品的低鹽標(biāo)準(zhǔn)，可滿足消費者對低鹽健康食品的需求。本實驗的蝦醬中未檢出有害的重金屬Pb、Cd、As以及致病菌，經(jīng)過滅菌而制成的成品蝦醬中的菌落總數(shù)小于10 CFU/g。因此，本實驗所用蝦醬的理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合食用安全標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 微生物多樣性分析

對基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖1），擴(kuò)增后得到清晰明顯的條帶，DNA濃度達(dá)到擴(kuò)增的要求，可用于后續(xù)的研究分析，委托生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行高通量測序。

圖1 DNA檢測電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of PCR amplified genomic DNA from bacteria in shrimp sauce

通過細(xì)菌的16S rDNA基因V3-V4測序，共獲得61 255 個序列，平均長度479.19 bp。質(zhì)控之后，共有61 107 個序列，平均長度427.20 bp。所有序列在97%的相似水平下進(jìn)行OTU統(tǒng)計分析，共獲得4 358 個OTU。

表2 蝦醬樣品的序列豐度和微生物多樣性Table 2 Sequence abundance and microbial diversity in shrimp sauce

蝦醬樣品的ACE和Chao1指數(shù)可以反映出群落分布豐度，由表2可以看出，蝦醬樣品中的微生物群落的種群多樣性和總體豐度較高。Shannon和Simpson以及Coverage指數(shù)可以反映出群落分布多樣性，其中Shannon指數(shù)越大，表明微生物群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)越大，表明微生物群落多樣性越低，Coverage指數(shù)則反映了樣品的覆蓋率[23]。由表2可以看出，蝦醬中微生物群落多樣性處于較高的水平，覆蓋率可達(dá)94%，說明樣品覆蓋率高，樣品中序列沒有被測出的概率較低，測序結(jié)果具有真實性。

2.3 蝦醬細(xì)菌群落門和綱水平分布

本實驗中共鑒定出蝦醬的1 4 個細(xì)菌門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、疣微菌門（V e r r u c o m i c r o b i a）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、螺旋菌門（Spirochaetes）、Candidatus Saccharibacteria、Candidate division WPS-1、未分類菌群（unclassified）。對蝦醬主要組成的14 個門進(jìn)行門水平菌群比例分布繪圖，結(jié)果如圖2所示。由圖2、3可知，蝦醬中變形菌門為優(yōu)勢的菌群門，達(dá)到92.02%，而在變形菌門中γ-變形菌綱比例最高，是主要的菌群綱。梭桿菌門和厚壁菌門比例較低，僅為3.97%和3.38%。變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要組成部分，在人體[24]、蝦類[25]、蟹類[26-27]中廣泛存在。Jack等[28]研究了普利茅斯沿海地區(qū)的海水，發(fā)現(xiàn)變形菌門是優(yōu)勢菌群門。對養(yǎng)殖池塘中的水體研究也發(fā)現(xiàn)變形菌門為優(yōu)勢類群[29-31]。本研究所用的麻蝦來源于黃海，其中主要的細(xì)菌類群是變形菌門[32]，因此以變形菌門為蝦醬中占主導(dǎo)作用的菌群可能與其原材料來源相關(guān)。變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，包括了很多的病原菌，如大腸桿菌、沙門氏菌、幽門螺桿菌等[33]，而變形菌帶菌率的高低主要和食品的新鮮、運輸和貯存的衛(wèi)生條件密切相關(guān)。因此，變形菌對蝦醬的品質(zhì)影響極大，需要在麻蝦醬的發(fā)酵生產(chǎn)和儲存過程中嚴(yán)格控制變形菌的生長，實現(xiàn)生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

圖2 門水平樣本菌群分布圖Fig. 2 Distribution frequency at phylum level of microbial communities from shrimp sauce

圖3 綱水平樣本菌群分布圖Fig. 3 Distribution frequency at class level of microbial communities from shrimp sauce

2.4 蝦醬細(xì)菌群落目和科水平分布

圖4 目水平樣本菌群分布圖Fig. 4 Distribution frequency at order level of microbial communities from shrimp sauce

圖5 科水平樣本菌群分布圖Fig. 5 Distribution frequency at family level of microbial communities from shrimp sauce

如圖4所示，本研究中共得到3 4 種細(xì)菌目，主要有弧菌目（V i b r i o n a l e s）、梭桿菌目（Fusobacteriales）、乳桿菌目（Lactobacillales）、交替單胞菌目（Alteromonadales）、假單胞菌目（Pseudomonadales）、彎曲菌目（Campylobacterales）和一些其他的菌群目。其中弧菌目比例達(dá)到85.91%，而梭桿菌目和乳桿菌目分別為3.97%和2.71%。如圖5所示，在科水平上，弧菌目和梭桿菌目中分別為弧菌科和梭桿菌科，而乳桿菌目中有1.28%的腸菌科、1.14%的肉桿菌科以及0.27%的鏈球菌科。因此，在目和科的水平上，弧菌目和弧菌科是最占優(yōu)勢的菌群。弧菌通常是海產(chǎn)品引起食物中毒的主要微生物源[34]，因此蝦醬的發(fā)酵過程需嚴(yán)格控制發(fā)酵條件，避免弧菌的滋生。本實驗中未檢測出弧菌，說明蝦醬具有極高的安全性。

2.5 蝦醬細(xì)菌群落屬水平分布

圖6 屬水平樣本菌群分布圖Fig. 6 Distribution frequency at genus level of microbial communities from shrimp sauce

由圖6可知，本研究共獲得20 個主要的細(xì)菌屬，分別是發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）、冷泥桿屬（Psychrilyobacter）、嗜冷菌屬（P s y c h r o b a c t e r）、摩替亞氏菌屬（Moritella）、弓形桿菌屬（Arcobacter）、肉食桿菌屬（Carnobacterium）、漫游球菌屬（Vagococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）、異單胞菌屬（Allomonas）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、射光桿菌屬（Lucibacterium）、Aliivibrio、Oceanisphaera、Jeotgalibaca、Echinimonas、Grimontia。其中發(fā)光桿菌屬是優(yōu)勢菌屬，所占比例達(dá)到71.94%；其次是弧菌屬，比例為12.54%；而冷泥桿屬、嗜冷菌屬、摩替亞氏菌屬和弓形桿菌屬比例較低，僅有3.93%、1.82%、1.47%和1.01%。Wanilada等[35]研究不同生長階段下黑虎蝦腸道細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)在黑虎蝦幼蟲期的后期發(fā)光桿菌屬是主要的細(xì)胞菌屬，而整個幼蟲期是以弧菌屬為主，發(fā)光桿菌屬和弧菌屬在蝦腸道中普遍存在[36-37]。對凡納濱對蝦腸道和三疣梭子蟹腸道進(jìn)行多樣性分析后也可得出相同的結(jié)論[38-39]。另外，發(fā)光桿菌屬能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，具有一定的抑菌活性，因此可以在一定程度上產(chǎn)生特異生物活性代謝物，抑制蝦醬中病原菌的生長[40]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)光桿菌屬是引起食品腐敗的主要菌屬[41]，且發(fā)光桿菌可在高鹽的環(huán)境中產(chǎn)生生物胺，食品中生物胺含量達(dá)到1 000 mg/kg時便會對人體健康造成極大的危害[42]。高溫對降低生物胺含量具有顯著效果，因此在蝦醬罐裝前，可通過適當(dāng)高溫煮制，降低蝦醬中生物胺含量[43]。

3 結(jié) 論

本研究利用高通量測序技術(shù)分析自然發(fā)酵產(chǎn)品蝦醬中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，研究共獲得61 107 條序列，4 358 個OTU。對蝦醬進(jìn)行微生物多樣性分析后共得到26 個門、41 個綱、59 個目、124 個科、315 個屬。蝦醬中的優(yōu)勢菌群分別是變形菌門、γ-變形菌綱、弧菌目、弧菌科、發(fā)光桿菌屬和弧菌屬，就門水平來說，變形菌門是最占優(yōu)勢的菌群門，占到92.02%，在蝦中廣泛存在，且與蝦的養(yǎng)殖環(huán)境密切相關(guān)。通過探討蝦醬中的細(xì)菌群落組成，可以把握蝦醬中優(yōu)勢菌群的分布情況，了解到優(yōu)勢菌群會對蝦醬的質(zhì)量與安全以及品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。其中變形菌門、弧菌和發(fā)光桿菌在某種程度上都對蝦醬具有潛在的危害性，因此為控制這些安全隱患，可以從麻線蝦的處理、蝦醬的發(fā)酵環(huán)境、罐裝溫度等生產(chǎn)工藝條件進(jìn)行改進(jìn)，將生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化以降低風(fēng)險。這對于保證蝦醬的質(zhì)量與安全，提高蝦醬的品質(zhì)和營養(yǎng)價值具有重要意義。