張 沛，李 瑩，王增利，王世平*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

三聚氰胺（1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺）是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，其改性樹脂被廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)。但因其含氮量高曾被不法分子添加到食品、嬰兒奶粉中人為改造粗蛋白含量[1]，三聚氰胺的過量攝入可能造成膀胱和腎結(jié)石，嚴(yán)重威脅人類健康[2-3]。目前，三聚氰胺的檢測方法主要有：高效液相色譜法[4-5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6-7]、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]和毛細(xì)管電泳法[9]等，但上述檢測方法存在儀器大型且昂貴、操作繁瑣、耗時(shí)等缺點(diǎn)不適合常規(guī)檢測。電化學(xué)法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]、近紅外光譜法[12]等近年來用于檢測三聚氰胺的方法也具有復(fù)雜的化學(xué)合成過程，低靈敏度等缺點(diǎn)，因此如何開發(fā)一種快速、靈敏的檢測方法備受關(guān)注。

雞蛋膜是指位于蛋殼和蛋清之間的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的雙層蛋白膜，其纖維表面具有—NH2、—OH、—CHO、—SH等活性基團(tuán)[13]，比表面積大，為許多能和蛋白質(zhì)形成價(jià)鍵或分子間力結(jié)合的物質(zhì)提供豐富的活性位點(diǎn)，是一種良好的天然生物膜材料[14]。Choi等[15]最早利用酶固定化的雞蛋膜，構(gòu)建了檢測硫代葡萄糖苷的熒光傳感器。Liu Wenyuan等[16]利用雞蛋膜合成鉑納米顆粒實(shí)現(xiàn)人血漿中葡萄糖的準(zhǔn)確測定。但當(dāng)前雞蛋膜生物傳感材料的研究主要集中于將酶和抗體等生物大分子進(jìn)行固定[17]，而對氨基酸、熒光團(tuán)等生物小分子的研究較少。

基于溶液中三聚氰胺與熒光素的相互作用，本研究選擇具有剛性平面結(jié)構(gòu)的熒光素作為熒光探針，構(gòu)建以雞蛋膜為基底的熒光傳感器，通過熒光強(qiáng)度線性變化測定三聚氰胺的含量，并對其進(jìn)行定性結(jié)構(gòu)分析和定量方法學(xué)考察，進(jìn)一步應(yīng)用于市售奶制品中三聚氰胺的檢測，以期構(gòu)建準(zhǔn)確、實(shí)用的三聚氰胺熒光傳感器快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋（產(chǎn)地遼寧省朝陽市，產(chǎn)蛋雞為雞齡9個(gè)月的褐殼蛋雞）、伊利純牛奶、三元酸牛奶、蒙牛營養(yǎng)奶粉北京市購。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、熒光素（均為分析純） 北京百靈威科技有限公司；NaOH、乙腈、正己烷、25%戊二醛等均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水取自Milli Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；JSM-6360掃描電子顯微鏡 日本JEOL公司；Spectrum100紅外光譜儀 美國Perkin Elmer公司；SHA-B恒溫水浴搖床 北京愷欣世紀(jì)科技發(fā)展有限公司；DH-101電熱鼓風(fēng)干燥箱 金壇市榮華儀器制造有限公司；TGL18M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 鹽城市凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋膜傳感器材料的制作和保存

將雞蛋破碎，取蛋殼并手工剝離雞蛋膜，用4 ℃的超純水反復(fù)清洗干凈后將其裁剪成1 cm×1 cm的雞蛋膜片，洗凈后置于4 ℃的超純水中浸泡保存。

1.3.2 溶液中熒光素與三聚氰胺作用體系熒光強(qiáng)度的確證

將1.0×10-4mol/L熒光素乙醇溶液與用0.1 mol/L的HCl/NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0的緩沖液等體積混合后，基于三維熒光譜圖測定其在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光峰強(qiáng)度。隨后，向該溶液中分別加入等體積不同質(zhì)量濃度（1、10、20、50、100、500 ng/mL）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，振蕩、靜置10 min后在同樣條件下記錄熒光圖譜，通過比較加入前后的熒光強(qiáng)度，確證熒光增強(qiáng)作用的發(fā)生。

1.3.3 雞蛋膜熒光傳感法測定三聚氰胺體系的構(gòu)建

1.3.3.1 熒光素的固定流程：

將雞蛋膜取出后，浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的pH 7.0的戊二醛溶液中，磁力攪拌2 h后取出并清洗，然后將雞蛋膜浸入等體積1.0×10-4mol/L的熒光素乙醇溶液、pH 7.0的緩沖液中，在25 ℃的恒溫水浴搖床中振蕩1 h后取出，沖洗干凈后于烘箱中干燥，置于避光處備用。

1.3.3.2 固定化反應(yīng)的掃描電子顯微鏡及紅外光譜表征

分別準(zhǔn)備固定化反應(yīng)前后的1 cm×1 cm的雞蛋膜片，自然晾干，將樣品鍍金后于JSM-6360掃描電子顯微鏡在8 kV加速電壓下，放大倍數(shù)5 000采集樣品圖像并對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，確證固定化反應(yīng)的發(fā)生。

分別將固定化反應(yīng)前后的雞蛋膜晾干，稱取少量剪碎的樣品與200 mg干燥KBr混合研磨，壓片后置于紅外光譜儀中進(jìn)行全掃描，收集光譜圖并從基團(tuán)和價(jià)鍵方面進(jìn)行分析。

1.3.4 雞蛋膜熒光傳感器測定三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，按照1.3.3.1節(jié)的方法制作熒光傳感器，并分別將1、5、10、20、50、100、200、300、400、500 μg/L的三聚氰胺溶液10 μL均勻的涂于雞蛋膜片的表面，反應(yīng)10 min，測定各傳感器反應(yīng)前后在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光峰值。計(jì)算熒光差值ΔF，結(jié)果取6 次測量的平均值，并繪制反應(yīng)前后ΔF對三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的曲線。

式中：F0、F分別為三聚氰胺加入前、后的熒光強(qiáng)度。

1.3.5 雞蛋膜熒光傳感器用于市售奶制品中三聚氰胺的測定

選取市售3 種奶制品并對其進(jìn)行處理，分別移取1 mL牛奶樣品于離心管中，加入5 mL HCl酸化的乙腈（pH 2.0），超聲10 min，使蛋白質(zhì)沉淀，以 8 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移合并上清液，向上清液中加入20 mL正己烷，振蕩、靜置、棄上層，將下層清液減壓蒸干、水溶，用0.45 μm微孔濾膜過濾得清液。取處理后的樣品10 μL均勻的涂于雞蛋膜片的表面，室溫避光反應(yīng)10 min，測定各傳感器反應(yīng)前后在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光峰值并確定三聚氰胺含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶液中熒光素與三聚氰胺熒光強(qiáng)度變化體系的分析

圖1 熒光素在不同質(zhì)量濃度三聚氰胺下的熒光光譜圖Fig. 1 Fluorescence emission spectra of fl uorescein with the addition of different concentrations of melamine

如圖1所示，熒光素在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光峰值在加入三聚氰胺溶液后明顯增強(qiáng)，這可能是因?yàn)闊晒馑嘏c三聚氰胺發(fā)生反應(yīng)，氨基上的n電子激發(fā)轉(zhuǎn)移到雜環(huán)上而產(chǎn)生激發(fā)態(tài)，氨基上的n電子的電子云幾乎與熒光素芳環(huán)上的π軌道平行，共享了共軛π電子結(jié)構(gòu)，同時(shí)擴(kuò)大其共軛雙鍵體系，從而增強(qiáng)熒光素的熒光強(qiáng)度。

通過溶液反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著三聚氰胺質(zhì)量濃度的升高，熒光強(qiáng)度不斷增大，通過熒光差值的計(jì)算，可以實(shí)現(xiàn)對三聚氰胺的定量檢測。溶液中兩者作用體系的確立，為構(gòu)建三聚氰胺的雞蛋膜熒光傳感系統(tǒng)提供建立基礎(chǔ)。

2.2 雞蛋膜傳感器制備條件的優(yōu)化研究

2.2.1 熒光素固定量的優(yōu)化

將不同濃度的熒光素分別固定在雞蛋膜上，各處理在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光峰值變化如圖2所示，隨著熒光素濃度的升高熒光峰值逐漸增強(qiáng)，在1.0×10-4mol/L以上，熒光強(qiáng)度穩(wěn)定或略有下降，這可能是因?yàn)殡u蛋膜上的活性位點(diǎn)在此濃度下基本達(dá)到飽和[18]，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度不再繼續(xù)上升。熒光素濃度過高時(shí)，部分未被激發(fā)的基態(tài)分子能與激發(fā)態(tài)分子形成不發(fā)熒光的二聚物，且該二聚物能夠吸收部分激發(fā)光，從而產(chǎn)生熒光內(nèi)濾效應(yīng)使熒光強(qiáng)度下降，因此導(dǎo)致過高的熒光素濃度對應(yīng)低的熒光強(qiáng)度。故選取1.0×10-4mol/L熒光素進(jìn)行固定化反應(yīng)。

圖2 熒光素濃度對傳感器熒光峰值的影響Fig. 2 Effect of fl uorescein concentration on the peak of the fl uorescence sensor

2.2.2 pH值的優(yōu)化

圖3 pH值對傳感器熒光峰值的影響Fig. 3 Effect of pH on the peak of the fl uorescence sensor

如圖3所示，在HCl-NaOH緩沖液中，隨著pH值的升高，熒光強(qiáng)度逐漸降低，pH 7時(shí)熒光強(qiáng)度最大。熒光素的熒光量子產(chǎn)率對酸極其敏感，在近中性和堿性介質(zhì)中發(fā)強(qiáng)熒光[19-20]，三聚氰胺在強(qiáng)酸條件下易失去氨基轉(zhuǎn)化成三聚氰酸[21]，對于生化檢驗(yàn)的樣品而言，酸性過強(qiáng)或堿性過強(qiáng)都會(huì)導(dǎo)致樣品變性，因此選擇pH 7的HCl-NaOH緩沖液最為合適。

2.2.3 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的優(yōu)化

圖4 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對傳感器熒光峰值的影響Fig. 4 Effect of glutaraldehyde concentration on the peak of the fl uorescence sensor

如圖4所示，隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，熒光強(qiáng)度先急劇上升，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)達(dá)到最大，之后隨著戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高熒光強(qiáng)度略有下降。戊二醛具有一定的毒性，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高容易造成生物分子的失活[22]，質(zhì)量分?jǐn)?shù)過低時(shí)不能保證熒光素在雞蛋膜上的固定量，因此選取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的戊二醛作為交聯(lián)劑。

2.3 固定化反應(yīng)的定性表征及分析

2.3.1 掃描電子顯微鏡表征及分析

圖5 傳感器交聯(lián)化反應(yīng)前（a）、后（b）的掃描電子顯微鏡圖像Fig. 5 SEM images of biosensor before (a) and after (b)cross-linking reaction

如圖5所示，交聯(lián)前的雞蛋膜清晰可見層層交錯(cuò)的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[23]，而交聯(lián)后，雞蛋膜表面纖維狀結(jié)構(gòu)則被戊二醛完全覆蓋，圖像對比直觀證明了交聯(lián)劑戊二醛將雞蛋膜表面改造成為穩(wěn)定、均勻的傳感器膜，充分發(fā)揮雞蛋膜作為反應(yīng)基底的作用，使傳感器在熒光測定中充分顯示熒光素的性質(zhì)。戊二醛還可作為保水劑，將水分鎖定在膜片表面[24]，使其重復(fù)性得到保障。

2.3.2 紅外光譜表征及分析

圖6 雞蛋膜（a）、戊二醛交聯(lián)雞蛋膜（b）、固定化熒光素的雞蛋膜（c）的紅外光譜圖Fig. 6 FTIR spectra of eggshell membrane (a), glutaraldehyde crosslinked eggshell membrane (b), and fl uorescein-immobilizedglutaraldehyde crosslinked eggshell membrane (c)

對空白雞蛋膜、戊二醛處理后的雞蛋膜和固定熒光素的雞蛋膜分別利用紅外光譜進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。從圖6a可以看出，空白雞蛋膜的紅外譜圖主要有3 個(gè)特征吸收峰，分別為3 317 cm-1處的—O—H和N—H伸縮振動(dòng)；3 069、2 935 cm-1和2 877 cm-1處的C—H基團(tuán)的不對稱伸縮振動(dòng)；1 643 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)，位于酰胺I 區(qū)；1 524 cm-1和1 235 cm-1處的C—N伸縮振動(dòng)和N—H彎曲振動(dòng)，分別位于酰胺II、III區(qū)；1 448、1 082 cm-1和620 cm-1處的C=C、C—O和C—S伸縮振動(dòng)。與空白雞蛋膜的特征吸收峰值相比，圖6b的戊二醛交聯(lián)后的雞蛋膜在酰胺I、II和III區(qū)的峰位置分別藍(lán)移了7、8 cm-1和2 cm-1，表明雞蛋膜蛋白的氨基與戊二醛的醛基結(jié)合使氫鍵減弱[25-26]。固定熒光素后，紅外譜圖6c中出現(xiàn)1 158 cm-1和1 121 cm-1兩個(gè)特征吸收峰，由C—O—C伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，表明熒光素的—OH與戊二醛的—CHO相交聯(lián)。綜上所述，紅外光譜分析從化學(xué)結(jié)構(gòu)上證明已成功利用戊二醛將熒光素固定到雞蛋膜上。

2.4 雞蛋膜熒光傳感器檢測三聚氰胺的方法學(xué)評價(jià)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及分析

用雞蛋膜熒光傳感器測定不同質(zhì)量濃度（1、5、10、20、50、100、200、300、400、500 μg/L）的三聚氰胺溶液的熒光差值Δ F（結(jié)果取6 次測量的平均值）與三聚氰胺質(zhì)量濃度的線性擬合曲線。擬合曲線中有兩個(gè)線性良好的質(zhì)量濃度范圍段，分別為1～100 μg/L三聚氰胺，擬合公式為：ΔF=1.792C+22.38（R2=0.996 8），100～500 μg/L三聚氰胺，擬合公式為：Δ F=0.8 2 3 C+11 2.7（R2=0.998 2），其中C為三聚氰胺的質(zhì)量濃度。

參照IUPAC[27]所規(guī)定的公式（CDL=3Sb/a，其中3為置信水平，a為校正曲線斜率，Sb為空白樣品平行檢測10 次的標(biāo)準(zhǔn)偏差）得此雞蛋膜熒光傳感器的檢出限為0.47 μg/L，對10、500 μg/L三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，測得其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.28%和 1.05%，結(jié)果表明以雞蛋膜為固相基質(zhì)的三聚氰胺熒光傳感器測定重復(fù)性良好，結(jié)果穩(wěn)定可信。

2.4.2 共存物質(zhì)對雞蛋膜熒光傳感器測定三聚氰胺的干擾實(shí)驗(yàn)

表1 共存物質(zhì)的影響Table 1 Inf l uence of coexisting substances

當(dāng)三聚氰胺質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時(shí)，分別將10 μL奶制品中常見物質(zhì)的最大允許倍數(shù)質(zhì)量濃度的溶液（表1）均勻涂抹到雞蛋膜片后進(jìn)行檢測，并計(jì)算測定共存物質(zhì)的傳感器在Ex/Em為505 nm/525 nm處的熒光差值ΔF與檢測三聚氰胺得到的ΔF之間的相對誤差，控制相對誤差在±5%范圍內(nèi)。從表1可以看出，常見的陰離子（Cl-、PO43-、SO42-）和常見的堿金屬離子、堿土金屬離子（Na+、K+、Ca2+、Mg2+）幾乎不會(huì)對三聚氰胺檢測產(chǎn)生任何干擾。熒光氨基酸（色氨酸[28]、苯丙氨酸）、賴氨酸以及奶制品中的主要營養(yǎng)成分也不會(huì)對檢測產(chǎn)生干擾，葡萄糖、乳糖等可能通過靜電作用或分子間作用力與熒光素作用從而影響熒光強(qiáng)度，但實(shí)際樣品中的兩者含量遠(yuǎn)小于該最大允許倍數(shù)，且可通過適當(dāng)預(yù)處理：如加入葡萄糖苷酶或乳糖酶等消除干擾[29-30]。綜上所述說明該雞蛋膜熒光傳感器對三聚氰胺的檢測具有較高的選擇性，能夠?qū)崿F(xiàn)對常見奶制品中三聚氰胺的定量檢測。

2.4.3 實(shí)際樣品的檢測效果驗(yàn)證以及加標(biāo)回收分析

按照1.3.5節(jié)的方法處理樣品，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下用該傳感器對3 種奶制品進(jìn)行檢測，結(jié)果均未檢出三聚氰胺。如表2所示，分別向3 種樣品中添加10 μg/L的三聚氰胺后做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各樣品加標(biāo)回收率均能控制在（100±5）%以內(nèi)，說明此傳感器能夠?qū)θ矍璋愤M(jìn)行有效測定。又由于雞蛋膜熒光傳感器具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、操作簡單、測量迅速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此經(jīng)過適當(dāng)?shù)母脑旌笤搨鞲衅骺梢栽诳焖贆z測領(lǐng)域有更廣泛的應(yīng)用前景。

表2 雞蛋膜傳感器測定奶制品中三聚氰胺的加標(biāo)回收率Table 2 Recovery of melamine in spiked milk products by eggshell membrane biosensor

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種以雞蛋膜為生物基底，固定上已用0.1 mol/L的HCl/NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的戊二醛溶液，然后選擇1.0×10-4mol/L熒光素作為熒光探針的固體熒光傳感器，在最佳優(yōu)化條件下，發(fā)現(xiàn)三聚氰胺的定量檢測有兩個(gè)線性良好的質(zhì)量濃度范圍段，分別為1～100 μg/L和100～500 μg/L，檢出限可低至0.47 μg/L。共存物質(zhì)的干擾實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，奶制品中的常見物質(zhì)幾乎不會(huì)對檢測產(chǎn)生任何干擾。此外將該雞蛋膜傳感器應(yīng)用于市售奶制品中三聚氰胺的檢測，均未檢出三聚氰胺，加標(biāo)結(jié)果顯示回收率均能控制在（100±5）%以內(nèi)，說明該方法能實(shí)現(xiàn)對三聚氰胺的快速、準(zhǔn)確測定，方法對三聚氰胺的檢測具有較高的選擇性、特異性強(qiáng)、干擾小，該固相傳感器的重復(fù)性良好。本研究利用廉價(jià)且易得的雞蛋膜材料構(gòu)建一種特異性檢測三聚氰胺的傳感器，為三聚氰胺的快速檢測提供更廣闊的思路，因雞蛋膜表面豐富的活性基團(tuán)及纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在雞蛋膜的修飾改造并擴(kuò)展其應(yīng)用方面還需進(jìn)一步深入研究。