曾錦江，盧 勇，牛得草，譚偉明，米 華

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，南寧 530021)

氯胺酮是N-甲基-D-門冬氨酸受體的拮抗藥[1]，因其致幻及中樞興奮等特性被濫用于各類娛樂場所，現(xiàn)為當(dāng)今流行毒品K粉的主要成分。在2007年SHAHANI等[2]首次報(bào)道9例濫用氯胺酮造成泌尿系統(tǒng)損害后，氯胺酮相關(guān)性泌尿系統(tǒng)損害(ketamine associate urinary dysfunction，KAUD)才引起人們的重視，KAUD起初主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、急迫性尿失禁、尿痛、血尿等，隨著病情進(jìn)展可導(dǎo)致膀胱攣縮和上尿路損害，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。目前氯胺酮濫用致泌尿系統(tǒng)損害的相關(guān)研究大多停留在臨床病例報(bào)道，臨床上更是缺乏統(tǒng)一有效的治療手段。近期有研究表明，氯胺酮通過氧化應(yīng)激損傷的激活導(dǎo)致膀胱炎及細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展[1,3]。褪黑素作為安全、不良反應(yīng)小的抗氧化劑，可在機(jī)體氧自由基刺激下，活化和增加血紅素氧化酶-1(HO-1)表達(dá)出明顯的抗氧化、抗炎和抗凋亡的保護(hù)效應(yīng)[4]。鑒于KAUD在臨床上下尿路癥狀突出表現(xiàn)，與之相關(guān)腎損害往往被忽視，而GIMONA等[5]報(bào)道一些氯胺酮濫用導(dǎo)致腎功能不全者的腎穿刺檢查結(jié)果顯示腎小管破壞、血管及間質(zhì)再生，提示氯胺酮導(dǎo)致上尿路損害可能是直接損傷為主。本研究旨在建立氯胺酮導(dǎo)致大鼠腎損害模型，探討褪黑素對氯胺酮相關(guān)性腎損害的保護(hù)機(jī)制為揭示其中相關(guān)的發(fā)病機(jī)制和治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 鹽酸氯胺酮注射液(規(guī)格100 mg/2 mL)購于福建古田制藥有限公司；褪黑素1 g購自美國Sigma公司；谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；HO-1一抗購自英國Abcam公司，內(nèi)參β-actin和二抗(羊抗兔)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.1.2主要儀器 電動勻漿機(jī)購自德國IKA公司；低溫離心機(jī)購自德國Eppendorf公司； MK3酶標(biāo)儀購自上海雷博生物技術(shù)有限公司；組織切片機(jī)購自德國Leica公司；熒光顯微鏡及顯微鏡照相系統(tǒng)購自日本Olympus公司；微量加樣器購自德國Eppendorf公司；雙垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀購自上海天能科技有限公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD雄性大鼠32只，體質(zhì)量190～210 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于溫度、濕度適宜的動物房，本研究已通過動物倫理委員會審核。

1.2方法

1.2.1建立氯胺酮致SD大鼠腎損害模型 參考YEUNG等[6]成功造模及結(jié)合本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，將32只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為A組(等量生理鹽水)、B組(氯胺酮30 mg/kg)、C組(褪黑素5 mg/kg)及D組(氯胺酮30 mg/kg+褪黑素5 mg/kg)，各組大鼠每天09:00予以腹腔注射給藥，持續(xù)12周。褪黑素用量參照文獻(xiàn)[4,7]實(shí)驗(yàn)的最佳用量。建模過程中，每3天稱1次各組大鼠體質(zhì)量以調(diào)整用藥量。大鼠于12周后采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，固定、常規(guī)備皮，充分暴露大鼠腹主動脈及腎臟，用采血針取腹主動脈血5 mL并置于4 ℃冰箱中靜置30 min后取上清液送至廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室平臺行血清肌酐及尿素氮檢測。同時迅速分離右側(cè)新鮮腎臟，置于-20 ℃保存，用于氧化指標(biāo)及Western blot檢測，隨后應(yīng)用4%多聚甲醛緩沖液灌注固定后，取左側(cè)腎臟浸泡于多聚甲醛緩沖液內(nèi)用于組織學(xué)相關(guān)檢測。

1.2.2氧化指標(biāo)測定 準(zhǔn)確稱取預(yù)先保存的各組大鼠新鮮右側(cè)腎臟制備成10%的組織勻漿(冰浴下)，4 ℃ 25 000 r/min，離心5 min。取上清液后用冰生理鹽水稀釋成1%的勻漿。各組MDA水平用硫代巴比妥酸(TBA)法測定，各組腎組織中SOD及GSH-Px水平采用直接比色法檢測，組織蛋白水平用微量酶標(biāo)法(BCA)測定。

1.2.3腎組織切片蘇木精-伊紅(HE)及馬松(Masson)染色 各組大鼠腎組織用4%多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)行脫水、透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm厚度石蠟切片，隨后行貼片、脫蠟、水化、HE染色及Masson染色和封片等步驟，在顯微鏡下觀察各組大鼠腎實(shí)質(zhì)、間質(zhì)等形態(tài)變化。

1.2.4TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡 各組腎臟石蠟切片常規(guī)脫蠟后，用3%過氧化氫甲醇溶液清除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。隨后，滴加蛋白酶K工作液20 μg/mL,室溫下孵育30 min,用PBS沖洗3次后，滴加TUNEL反應(yīng)液，置于孵育盒中室溫下孵育60 min。滴加轉(zhuǎn)化劑-酶標(biāo)記抗熒光素抗體(POD)之后，再次置于孵育盒中孵育25 min，隨后用加入配好的二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色液，顯色5 min并在顯微鏡下觀察顏色深淺控制染色強(qiáng)度，將切片置于HE染液復(fù)染，常規(guī)脫水、透明及封閉后顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.2.5Western blot測定組織蛋白表達(dá) 稱取新鮮保存腎組織置于1.5 mL離心管，剪碎后加入蛋白質(zhì)裂解液(RIPA)和蛋白酶抑制劑(PMSF)，冰浴下勻漿之后靜置30 min，4 ℃ 15 000 r/min、離心5 min，取上清液采用BCA法測蛋白水平以調(diào)整上樣量。隨后加入上樣緩沖液，高溫至蛋白質(zhì)變性，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉及漂洗。將膜置于一抗HO-1(兔抗鼠，1∶15 000)及內(nèi)參β-actin(1∶500)孵育盒，4 ℃搖床過夜，TBST洗膜后，二抗按照1∶10 000稀釋，4 ℃搖床孵育3 h，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)下掃膜、拍照并測量灰度值，分析結(jié)果。計(jì)算目的蛋白的灰度值和內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為及腎功能指標(biāo)比較 與A組比較，B、D組大鼠立即出現(xiàn)活動增加、共濟(jì)失調(diào)，隨后平靜不動；而D組大鼠活躍持續(xù)及平靜到恢復(fù)正常的時間均比B組短。以體質(zhì)量為協(xié)變量調(diào)整后，各組大鼠血肌酐及尿素氮采用協(xié)方差分析結(jié)果顯示，B組血肌酐、尿素氮水平較其余各組明顯升高(P<0.05)，而C、D兩組大鼠血肌酐、尿素氮與A組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.2各組大鼠腎組織中SOD、GSH-Px及MDA水平比較 與B組比較，A、C、D組MDA水平明顯降低，SOD、GSH-Px水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而C組中MDA水平與A組無明顯差異，SOD及GSH-Px水平與D組無明顯差異(P>0.05)，見表1。

a：P<0.05,與A組比較；b：P<0.05,與B組比較

表1 各組大鼠腎組織中SOD及MDA等水平比較

a:P<0.05，與B組比較；b:P<0.05，與A組比較

圖2 大鼠腎組織HE染色及Masson染色結(jié)果(×200)

2.3腎臟組織HE及Masson染色結(jié)果 光鏡下HE染色可見A、C組大鼠腎組織無明顯單核炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球及腎小管形態(tài)正常；B組大鼠腎間質(zhì)和腎小球周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，多處局灶性壞死，甚至出現(xiàn)腎小球萎縮、封閉；與B組比較，D組大鼠炎癥細(xì)胞浸潤減少，腎小球及腎小管尚完整，間質(zhì)破壞不明顯。Masson染色切片顯示，B組可見腎組織膠原染色加深,有條索狀纖維形成，D組膠原染色與A、C組無明顯差別，見圖2。

2.4各組TUNEL細(xì)胞凋亡結(jié)果 A、C組大鼠中腎組織偶見呈棕黃色的陽性細(xì)胞(凋亡細(xì)胞)，可能是正常細(xì)胞凋亡的假陽性結(jié)果；B組大鼠無論在腎實(shí)質(zhì)還在間質(zhì)陽性染色細(xì)胞明顯增多(P<0.05)；與B組比較，D組大鼠腎組織的陽性細(xì)胞減少明顯(P<0.05)，只出現(xiàn)少許凋亡細(xì)胞。凋亡細(xì)胞數(shù)半定量結(jié)果顯示，與A組比較，B組大鼠腎組織凋亡細(xì)胞明顯增加(P<0.05)，而D組凋亡細(xì)胞數(shù)量比B組明顯減少(P<0.05)，C、A組大鼠腎凋亡細(xì)胞比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3、4。

2.5各組大鼠腎組織HO-1蛋白表達(dá)水平 與A組比較，B、C、D組大鼠HO-1蛋白水平均明顯升高(P<0.05)；而D組中HO-1蛋白水平升高更明顯(P<0.05)，見圖5。

a:P<0.05，與A組比較；b:P<0.05，與B組比較；c:P<0.05，與C組比較

3 討 論

氯胺酮作為毒品“K粉”的主要成分，非法濫用情況逐年遞增，不容樂觀。氯胺酮的濫用對神經(jīng)、心血管系統(tǒng)及肝臟的毒副作用已有充分認(rèn)識，但關(guān)于KAUD研究目前僅限于臨床治療，相關(guān)的基礎(chǔ)研究也大多呈現(xiàn)單一性，未能系統(tǒng)深入的探究，導(dǎo)致臨床上尚無統(tǒng)一規(guī)范的治療，其發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究[8-9]。

氯胺酮濫用導(dǎo)致的泌尿系統(tǒng)損害由于突出的膀胱刺激癥狀，其相關(guān)性腎損害往往被忽視。GIMONA等[5]發(fā)現(xiàn)一些氯胺酮濫用導(dǎo)致腎功能不全者的腎穿刺檢查結(jié)果顯示，腎小管破壞、血管及間質(zhì)再生，提示氯胺酮導(dǎo)致上尿路損害可能是直接損傷為主，間接損害為輔的病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)，長期予以氯胺酮注射后，大鼠的血清肌酐及尿素氮水平明顯高于其余各組，同時在大鼠腎病理組織切片可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)腎小球萎縮，間質(zhì)纖維化嚴(yán)重等，甚至在TUNEL凋亡結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，腎間質(zhì)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增加，提示氯胺酮長期作用可導(dǎo)致腎臟的多種直接損害。盡管已發(fā)現(xiàn)長期濫用氯胺酮可導(dǎo)致嚴(yán)重泌尿系統(tǒng)損傷，可其治療方案卻無相關(guān)研究證據(jù)可循，對于一些嚴(yán)重腎積水并感染者，可行患側(cè)腎切除術(shù)，由于濫用氯胺酮患者主要為青少年群體，不主張輕易行外科手術(shù)治療，對于此類患者臨床上迫切需要有效而明確的藥物和治療手段的出現(xiàn)。

本研究發(fā)現(xiàn)長期予以氯胺酮后大鼠腎組織勻漿的MDA水平明顯增加，而抗氧化蛋白SOD、GSH-Px水平明顯降低，而在予以抗氧化劑褪黑素作用后能有效地降低MDA水平，并提高SOD、GSH-Px水平，另外僅予以褪黑素后SOD、GSH-Px水平也有不同程度提高，說明褪黑素能有效抵抗氯胺酮導(dǎo)致的腎組織氧化損傷和提高抗氧化相關(guān)蛋白表達(dá)。近年來，氧化應(yīng)激損傷成為學(xué)者們研究腎臟疾病的熱點(diǎn)，氧化損傷與反應(yīng)氮原子和活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生相關(guān)，ROS使體內(nèi)自由基增加，自由基中超氧化物和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA)可誘導(dǎo)細(xì)胞和組織相應(yīng)靶分子累積氧化變性或損傷，是造成細(xì)胞代謝和功能紊亂的基本環(huán)節(jié)和重要病理生理基礎(chǔ)[10-11]，褪黑素是哺乳動物中松果體產(chǎn)生的一種激素，研究表明其具有促進(jìn)睡眠和強(qiáng)大的抗氧化作用，其作為一種高效的抗氧化劑，能夠直接清除氧自由基從而減輕氧自由基對抗氧化酶的破壞，不僅其清除羥自由基的能力及清除烷過氧化物能力是維生素E的2倍[12]，而且其幾乎無任何有害不良反應(yīng)[13-14]，可在臨床上安全推廣。

相比于抗氧化酶SOD和GSH-Px，HO-1擁有更為強(qiáng)大的抗氧化特性，例如HO-1能促進(jìn)抗氧化代謝產(chǎn)物膽紅素和膽綠素的形成，可分解血紅素(具有強(qiáng)烈氧化毒性的底物)且減少細(xì)胞內(nèi)氧化劑鐵和鐵蛋白的合成[15]。由于HO-1具有上述突出的抗氧化特性，使得其成為近年來預(yù)防氧化損傷備受矚目的靶基因[16-17]。為了更進(jìn)一步闡明褪黑素治療氯胺酮對腎臟的氧化損傷是否與激活HO-1高表達(dá)相關(guān)，本研究通過Western blot技術(shù)觀察各組大鼠腎組織HO-1蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)僅長期予以氯胺酮注射后大鼠腎組織HO-1的蛋白水平增加并不明顯，但在增加褪黑素干預(yù)后HO-1蛋白水平明顯增加(P<0.05)，并且單獨(dú)予以褪黑素的大鼠腎組織HO-1水平也明顯增加(P<0.05)，說明氯胺酮可導(dǎo)致腎組織產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使得HO-1表達(dá)略微升高，只是機(jī)體的自身加強(qiáng)氧化系統(tǒng)防御的機(jī)制，但是遠(yuǎn)不足以抵抗氯胺酮所致的ROS和MDA水平的增加。相比之下，褪黑素可以有效增加HO-1蛋白水平，從而明顯抑制MDA水平，表明在氯胺酮導(dǎo)致腎氧化應(yīng)激性損傷后應(yīng)用褪黑素可有效增加HO-1蛋白水平，進(jìn)而拮抗SOD、GSH-Px耗竭，其機(jī)制可能與上調(diào)HO-1相關(guān)靶基因轉(zhuǎn)錄的激活有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，褪黑素能很大程度上改善氯胺酮導(dǎo)致腎臟氧化損傷，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物(如MDA)水平，提高組織抗氧化蛋白SOD、GSH-Px及HO-1的水平，從而減少炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞凋亡，腎小球萎縮、封閉及間質(zhì)纖維形成等，其保護(hù)機(jī)制可能與增加HO-1蛋白表達(dá)有關(guān)，而抵抗氧化損傷有望成為研究KAUD的藥物靶點(diǎn)。本研究對于揭示氯胺酮相關(guān)性腎損害的發(fā)病機(jī)制、設(shè)計(jì)合理的藥物治療靶點(diǎn)，為發(fā)掘更精確和個性化的診斷和治療方法可提供研究基礎(chǔ)。