賀東生，李錦輝，劉博聞，李 根，陳敏鴻

（華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510640）

冠狀病毒對人和家畜的危害嚴重。2002年由冠狀病毒（SARS-CoV）造成非典型性肺炎在中國南方暴發(fā)，導致超過8000人感染和774人死亡[1-5]。2018年3月馬靜云等在國外雜志《Nature》報道了在華南某豬場發(fā)生急性腹瀉疾病暴發(fā)的病例中分離鑒定出1個新的HKU2相關蝙蝠冠狀病毒——豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（Swine Acute Diarrhoea Syndrome Coronavirus SADS-CoV）[6]。本研究再次檢測到該病毒并首次在國內報道。

豬急性腹瀉綜合征的臨床癥狀與其他已知的豬腸道冠狀病毒引起的臨診癥狀非常相似：嚴重且急性嘔吐和腹瀉，新生仔豬體重迅速減輕導致急性死亡[7]。該病可感染各種年齡的豬，但對新生仔豬的影響最為嚴重，在5 d或更小日齡的仔豬中，死亡率高達90%，病后2～6 d死亡，而感染的母豬只有輕度腹瀉，大多數(shù)母豬在兩天內恢復。組織病理學檢查顯示發(fā)病仔豬的腸絨毛萎縮變短。

SADS與人的非典（SARS）在地理、時間、生態(tài)和病原學方面存在驚人的相似之處，引起極大關注。同時，冠狀病毒的多樣性和蝙蝠的地理分布之間存在重要關聯(lián)[8-10]。隨著規(guī)?；⒓s化養(yǎng)豬業(yè)的持續(xù)發(fā)展，豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒(SADS-CoV)已經(jīng)或可能給養(yǎng)殖業(yè)帶來潛在的重大經(jīng)濟損失。目前在國內該病尚缺乏快速有效地診斷方法和防控手段。本病是新發(fā)病，國內雜志缺乏報道，本文再次確證該病的存在和危害，同時對該病的診斷方法和病毒遺傳變異進行了系統(tǒng)研究，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源

病料于2017年11月采集自華南地區(qū)發(fā)生嚴重腹瀉的某豬場，該豬場發(fā)病仔豬表現(xiàn)為急性嘔吐和嚴重水樣腹瀉，新生仔豬（小于5日齡）急性死亡，病死率高達100%（含淘汰）。病豬臨床表現(xiàn)為精神不振，新生仔豬體重迅速減輕導致急性死亡，疑似為SADSCoV感染。采集病豬的腸道病料并保存在-80 ℃低溫冰箱，檢測為常規(guī)腹瀉病原陰性。數(shù)月后了解SADS-CoV，重新取出檢測。

1.1.2 主要試劑

DNA Marker，dNTP，Taq 酶 等購自寶生物工程(大連)有限公司，pMD 19-T載體、DHSa感受態(tài)細胞、DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒均購自Omega公司，DNA產(chǎn)物純化試劑盒購自TaKaRa公司，溴化乙錠、氨芐青霉素、IPTG為Sigma公司產(chǎn)品；其余的化學試劑均是進口或者國產(chǎn)分析純。引物合成、DNA測序由北京睿博興科生物技術有限公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基

氨芐青霉素(100 mg/mL)，LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基，LB選擇培養(yǎng)基等按常規(guī)方法配制。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

將待檢病料按照1：3加入PBS緩沖液進行稀釋研磨，-20 ℃反復凍融3次，12000 r/min離心15 min后取上清液，用0．22 um的微孔過濾器過濾除菌，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病毒總RNA的提取

按RNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸，然后-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計與合成

本實驗室根據(jù)GeneBank所發(fā)布的序列號，選擇全基因序列，運用Primer Premiers 5．0針對N基因設計1對SADS-CoV引物。由北京睿博興科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.4 SADS-CoV HN17N基因的PCR擴增

以病毒RNA為模板進行PCR擴增，反應體系為：2 × lstepBuffer 10 uL，RNase Free dH2O 5．6 uL，上下游引物各0．5 uL， DNA模板3 uL，Prime Script 1 step Enzyme Mix 0．4 uL。 PCR擴增程序為：50 ℃反轉錄30 min；94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；51 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min20 s；45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取6 uL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，CLINX凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.2.5 基因的克隆和測序

將陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與PMD-19T載體連接，轉化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，涂布含氨芐青霉素(100 mg/mL)LB平板，37 ℃培養(yǎng)后挑單個菌落接種含氨芐青霉素(100 mg/mL)LB液體培養(yǎng)基，37 ℃下150 r/min搖菌培養(yǎng)12 h，提取質粒DNA并進行鑒定，鑒定成功的重組質粒送往華大基因公司進行測序。

表1 SADS-CoV引物序列

1.2.6 基因序列分析

將PCR擴增獲得的基因片段進行克隆、測序，利用DNA Star和MEGA7軟件處理，與GeneBank上已公布的5株PEDV參考毒株、5株TGEV參考毒株、5株PDCoV參考毒株和5株SADS-CoV參考毒株的基因序列(表2)進行N基因同源性比對及遺傳變異分析。

表2 GeneBank已登錄的PEDV、TGEV、PDCoV、SADS-CoV參考毒株

2 結果與分析

2.1 病料PCR檢測結果

以提取的RNA為模板，用SADSCoV的N基因引物對樣品進行檢測。結果所示(見圖1)，SADS-CoV在1 155bp左右有明顯條帶，檢測結果為陽性。由此說明該病毒為SADS-CoV。將SADSCoV PCR產(chǎn)物純化后構建至pMD-19T質粒并進行測序，成功克隆了該病毒的目標序列，并獲得N段基因序列，序列長度為1 155bp。將SADS-CoV與GeneBank上已公布的5株PEDV參考毒株(表2)、5株TGEV參考毒株、5株PDCoV參考毒株和4株SADS-CoV參考毒株的基因序列進行N基因同源性比對及遺傳變異分析。

2.2 SADS-CoV HN17株N基因的序列同源性分析

SADS-CoV基因組ORF區(qū)編碼蛋 白 由 ORFab、S、NS3、E、M、N、NS7a組成。在結構蛋白中，N基因主要編碼病毒的核衣殼蛋白，N蛋白在病毒的復制和致病力中具有多種可能，因此，N 基因作為診斷SADS-CoV的靶基因的前景非常大。將SADS-CoV HN17株N基因測序結果和在Gene Bank上已公布的5株PEDV參考毒株、5株TGEV參考毒株、5株PDCoV參考毒株和5株SADS-CoV參考毒株的基因序列進行N基因同源性比對及遺傳變異分析，用DNA Star軟件進行同源性分析（圖2），分析結果表明，SADSCoV HN17株N基因與Gene Bank上已公布的SADS-CoV參考毒株的核 苷 酸 同 源 性 為 98．2% ～ 99．8%；與已公布的PEDV參考毒株的核苷酸同源性為54%～55．8%；與已公布的TGEV參考毒株的核苷酸同源性 為 48．5% ～ 49．2%；與 已 公 布 的PDCoV參考毒株的核苷酸同源性為35．9%～ 37．5%；該毒株與已公布的SADS-CoV參考毒株的核苷酸同源性均達到98%以上。

圖1 SADS-CoV HN17 N基因PCR擴增結果圖

2.3 基于SADS-CoV HN17株N基因的遺傳進化分析

以表2中的PEDV參考毒株、TGEV參考毒株、PDCoV參考毒株和SADS-CoV參考毒株為參考，運 用MEGA7．0軟 件 采 用Neighbor-Joining聚類分析方法構建基于N基因序列的進化樹(圖3)。SADS-CoV HN17 N基因與SADSCoVDCD7、SADS-CoV 57、SADSCoV DCD7 FarmA屬于同一分支，而與PEDV、TGEV、PDCoV毒株的親緣關系較遠。本次鑒定毒株為豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV），命名為SADS-CoV HN17。

圖2 基于SADS-CoV HN17毒株 N基因的序列同源性分析

圖3 基于SADS-CoV HN17株N基因的遺傳進化分析

3 討論

自SARS暴發(fā)以來，隨著人們對冠狀病毒研究的加深，冠狀病毒被認為是重要的病原體，而蝙蝠被認為是新型病毒最重要的宿主[11-13]。2018年馬靜云等首次報道豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）在華南的暴發(fā)，并將研究成果以論文的形式發(fā)表在國際雜志《Nature》上。本論文的研究是再次驗證在華南某豬場中的存在豬急性腹瀉綜合征的暴發(fā)。本研究鑒定出的SADSCoV HN17經(jīng)N基因遺傳進化分析顯示：該病毒與報道的豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）在本來保守的N基因中出現(xiàn)變異，在遺傳樹上屬于不同的毒株小分支，且其S蛋白存在較大的差異。此外，在病料庫中更早期的另一個豬場病料中也檢測為陽性，推測該病毒已在華南地區(qū)豬場不斷變異和蔓延擴散，有流行擴大的趨勢。為了進一步證明SADS-CoV HN17的致病性，本文在以上研究基礎上進行了病毒的分離和動物回歸實驗，獲得了成功，結果另文報道。

豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS-CoV）是新發(fā)現(xiàn)的一種新型冠狀病毒，目前，國內外對該病尚未開展全面系統(tǒng)的研究。考慮到該病毒導致仔豬發(fā)病率高、死亡率高及其對仔豬危害嚴重的臨床意義，迫切需要進一步加強其生物學特性以及致病性研究，提供防控預案，挽回養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟損失。

致謝

本實驗是在華南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院、人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室、農(nóng)業(yè)部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室和廣東省獸用生物技術研究與應用企業(yè)重點實驗室?guī)椭逻M行。感謝廣東省生豬產(chǎn)業(yè)體系創(chuàng)新團隊基金的資助。