浙江中醫(yī)藥大學藥學院 杭州 310053

近年來，隨著環(huán)境污染的日益嚴重，大氣臭氧層遭到破壞，紫外線照射日益強烈。紫外線可以促使人體皮膚中黑色素細胞合成黑色素，導致皮膚色素沉積失常，影響面容外觀，給人們帶來一定的心理和精神壓力，影響生活質(zhì)量[1]。酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，可以催化黑色素細胞中的酪氨酸生成黑色素，是黑色素合成過程的主要限速酶，其表達水平和活性決定著黑色素合成的速度和產(chǎn)量[2]。研究表明，抑制酪氨酸酶活性可以減少皮膚黑色素的生成，并具有良好的美白功效[3]。近年來隨著綠色自然理念的日益普及，植物成分的化妝品因取材天然、安全性高、符合消費者對健康的追求等特點，在化妝品領域異軍突起，眾多的研究者開始嘗試從植物提取物中篩選抑制酪氨酸酶活性的天然成分。

刺梨（Rosa roxburghii）為薔薇科薔薇屬植物繅絲花的果實，又名茨梨、木梨子、文光果、送春歸，為云貴高原特有的野生植物，有消食健脾、收斂止瀉的功效[4]。刺梨中含有豐富的維生素、多酚、黃酮、有機酸、多糖、氨基酸以及微量元素等物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價值[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，刺梨中多種活性成分，如刺梨多酚、刺梨黃酮、刺梨多糖等均具有抗衰老、抗氧化以及清除自由基的作用，在美白化妝品開發(fā)領域具有潛在的應用前景[7-8]。鄭殿欽[9]以刺梨為原料，開發(fā)了刺梨美白茶，發(fā)現(xiàn)其具有抗氧化、美白、健胃消食等作用。目前對于刺梨多糖、黃酮及多酚的提取技術(shù)和效率，以及其具體作用機制尚沒有系統(tǒng)研究，限制了刺梨作為美白添加劑的應用。本實驗以刺梨為原料，制備了刺梨多糖、黃酮及多酚提取物，并研究其對小鼠黑色素瘤B16細胞增殖及細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的影響，以期為刺梨在美白化妝品中的應用提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗藥材 刺梨采自貴州黔南，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學藥學院中藥資源研究所陳孔榮副教授鑒定為薔薇科薔薇屬植物繅絲花（Rosa roxburghii Tratt.）的果實。

1.2 細胞和主要試劑 小鼠黑色素瘤B16細胞購于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司（批號：BNCC 100653）。RPMI-1640培養(yǎng)基、胰酶、PBS均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司（批號：20170213、20170310、20170321）；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司（批號：20161207）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide,DMSO）、乙醇購于國藥集團化學試劑有限公司（批號：20170113、20170317）；四甲基偶氮唑藍購于杭州昊天生物技術(shù)有限公司（批號：3068B512）；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）購于上海源葉生物科技有限公司（批號：O25M8K32143）；Triton X-100、維生素C購于Sigma公司（批號：WXBC3534V、WXBB4747V）；大孔吸附樹脂HPD-600、AB-8購于滄州寶恩吸附材料科技有限公司（批號：20170421、20170422）。

1.3 主要儀器設備 BLX-800酶標儀為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜為美國Thermo公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品；UV-1800型紫外可見分光光度計購于日本島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 刺梨不同提取成分的制備及純度檢測

1.4.1.1 刺梨多糖 采用水提法提取刺梨多糖[10]。將干燥的刺梨果實粉碎，過50目篩，取適量粉末，放入圓底燒瓶中，加入50倍量的蒸餾水，在80℃下提取3次，每次1h。過濾得到多糖溶液，再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，得到多糖粉末，采用苯酚-硫酸法測定刺梨多糖純度[11]。

1.4.1.2 刺梨黃酮 采用醇提法提取刺梨黃酮[12]。將干燥的刺梨果實粉碎，過50目篩，取適量粉末，加入15倍量的80%乙醇，在90℃下提取3次，時間分別為80、40、40min。過濾得到黃酮溶液，再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干乙醇，濃縮液蒸干后得到粗黃酮浸膏，用HPD-600大孔吸附樹脂裝柱上樣，吸附1h，10倍柱體積的蒸餾水以4mL·min-1的流速洗去糖類等雜質(zhì)，10倍柱體積40%的乙醇以3mL·min-1的流速洗脫，得到洗脫液，再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，真空干燥得到刺梨黃酮粉末，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定刺梨黃酮純度[13]。

1.4.1.3 刺梨多酚 采用超聲提取法提取刺梨果實中的多酚[14]。將干燥的刺梨果實粉碎，過50目篩。稱取刺梨粉末，液料比100:1，加入70%乙醇，超聲功率250w，30℃超聲提取 40min，過濾，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，得到粗多酚浸膏。用AB-8大孔樹脂裝柱上樣，上樣液濃度 0.7mg·mL-1，上樣液 pH 5.9，流速 3mL·min-1；洗脫液濃度70%，洗脫液pH 6.3，流速3mL·min-1進行洗脫，得到洗脫液。再經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干水分，真空干燥得到刺梨多酚粉末，采用Folin-Ciocaltean法測定刺梨多酚純度[15]。

1.4.2 細胞培養(yǎng) 無菌條件下，將B16細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞生長至融合狀態(tài)，以胰酶消化傳代，每2d傳代1次。

1.4.3 實驗分組 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度至4×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100μL。37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育24h后，根據(jù)前期預實驗結(jié)果，將細胞分為空白組、正常組、刺梨多糖組（200、400、800、1 600μg·mL-1）、刺梨黃酮組（30、60、120、240μg·mL-1）、刺梨多酚組（40、80、160、320μg·mL-1），陽性對照組（維生素 C 90μg·mL-1）。正常組細胞中加入100μL不含藥物的培養(yǎng)基，空白組不接種細胞，代之等量培養(yǎng)基，其余各組分別加入100μL含有相應劑量藥物培養(yǎng)基。每組設置3個復孔，于37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育48h。

1.4.4 MTT法測定刺梨不同提取成分對B16細胞增殖活性的影響 按“1.4.3”項下方法處理細胞48h后，棄去培養(yǎng)液，以PBS洗滌1次，每孔加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基 100μL 和 5mg·mL-1的 MTT 溶液 20μL，在37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去上清液，每孔加入DMSO溶液150μL，震蕩5～10min使結(jié)晶充分溶解，酶標儀檢測A490，實驗重復3次。細胞增殖活性=[（藥物處理組A490-空白組A490）/（正常組 A490-空白組 A490）]×100%，計算 IC50。

1.4.5 倒置顯微鏡觀察刺梨不同提取成分對B16細胞形態(tài)的影響 收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度至 1×105個/mL，接種于 6 孔板中，每孔 1.5mL，37℃、5%CO2飽和濕度環(huán)境下孵育24h后，添加各含藥培養(yǎng)基，分組及藥物濃度同前，作用48h后，置于倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)、大小、生長密度及融合狀態(tài)等，并拍照記錄。

1.4.6 多巴氧化法測定刺梨不同提取成分對B16細胞酪氨酸酶活性的影響 按“1.4.3”項下方法處理細胞48h后，用PBS洗滌兩遍，每孔加1%TritonX-100溶液100μL，迅速放入-80℃冰箱凍存1h，隨后移至室溫下裂解細胞，37℃預溫后每孔加入濃度為0.1%的 L-DOPA 100μL，37℃水浴 2h，酶標儀檢測 A490，實驗重復3次。細胞酪氨酸酶活性=[（藥物處理組A490-空白組A490）/（正常組A490-空白組A490）]×100%。采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件計算IC50。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用±s表示,多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD-t法），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 刺梨不同部位的提取率和純度測定 刺梨不同提取成分的提取率差別較大，其中刺梨多糖的提取率最高，可達45.33%，是刺梨黃酮和刺梨多酚提取率的7.56和5.21倍。雖然刺梨黃酮提取率最低，僅為6.00%，但其純度顯著高于刺梨多糖和刺梨多酚，經(jīng)亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法檢測獲得的刺梨黃酮純度為52.50%，分別是刺梨多糖純度和刺梨多酚純度的1.56和1.69倍。見表1。

表1 刺梨不同提取成分的提取率及純度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

表1 刺梨不同提取成分的提取率及純度（±s，%）Tab.1 Extraction rate and purity of Rosa roxburghii different extraction parts(±s,%)

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2.2 刺梨不同提取成分對B16細胞增殖活性和形態(tài)的影響 刺梨的不同提取成分對B16細胞增殖均具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴性，和正常組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。藥物處理 48h后，400、800μg·mL-1的刺梨多糖組B16細胞的增殖活性分別是76.16%和45.01%，與正常組比較，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黃酮組細胞增殖活性為89.14%，當黃酮濃度增加到120μg·mL-1時，B16細胞的增殖活性可下降至48.81%，對細胞增殖的抑制效果是低濃度刺梨黃酮處理組的4.71倍，與正常組比較，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚處理48h后，B16細胞的增殖活性分別是84.27%和80.84%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），其對細胞增殖的抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黃酮之間。見表2。處理48h后，刺梨多糖、刺梨黃酮和刺梨多酚抑制B16細胞增殖的IC50分別為649.83μg·mL-1、105.87μg·mL-1、134.16μg·mL-1，其中刺梨黃酮對B16細胞增殖活性的抑制效果最佳，120、240μg·mL-1刺梨黃酮對B16細胞增殖的抑制作用優(yōu)于維生素C（P＜0.05或P＜0.01）。正常組細胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)正常，貼壁牢固，融合度好。不同濃度的刺梨提取物處理之后，細胞密度減少，細胞形態(tài)均出現(xiàn)了不同程度的變化，融合度降低，不能相互融合成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，隨著藥物劑量增加，細胞數(shù)量明顯減少，碎片增多。見圖1。

表2 刺梨不同提取成分對B16細胞增殖活性的影響（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

表2 刺梨不同提取成分對B16細胞增殖活性的影響（±s）Tab.2 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on proliferation of B16 cells(±s)

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:compared with normal group,*P＜0.05,**P＜0.01;compared with positive control group,#P＜0.05,##P＜0.01.

組別 藥物濃度（μg·mL-1） B16細胞增殖活性（%）正常組陽性對照組刺梨多糖0刺梨黃酮刺梨多酚90 200 400 800 1 600 30 60 120 240 40 80 160 320 100 54.29±4.4**93.14±3.21*76.16±5.97**45.01±4.63**#4.60±0.15**##89.14±2.7**83.52±3.74**48.81±3.54**#7.91±1.05**##84.27±2.82**80.84±3.23**45.34±1.84**#10.37±2.46**##

圖1 刺梨不同提取成分對B16細胞形態(tài)的影響（10×）Fig.1 Effects of different extracts of Rosa roxburghii on the morphology of B16 cells（10×）

2.3 刺梨不同提取成分對B16細胞酪氨酸酶活性的影響 刺梨多糖、刺梨黃酮、刺梨多酚對B16細胞酪氨酸酶活性均具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴性，與正常組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01）。刺梨不同提取成分對細胞酪氨酸酶活性的抑制差異較大，其中刺梨黃酮的效果最好，刺梨多糖最差。處理48h后，400μg·mL-1刺梨多糖組B16細胞酪氨酸酶活性為41.84%，800μg·mL-1刺梨多糖組酪氨酸酶活性僅為3.67%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。30μg·mL-1刺梨黃酮組 B16細胞酪氨酸酶活性為76.93%，120μg·mL-1刺梨黃酮組B16細胞酪氨酸酶活性下降為6.43%，其抑制效果是低濃度刺梨黃酮處理組的11.96倍，與正常組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），中、高濃度刺梨黃酮組（≥60μg·mL-1）細胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于陽性對照（P＜0.01）。40、80μg·mL-1的刺梨多酚處理 48h 后，B16 細胞的酪氨酸酶活性分別是95.96%和46.50%，與正常組比較，均具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05，P＜0.01），中、高濃度刺梨多酚組（≥80μg·mL-1）細胞內(nèi)酪氨酸酶活性顯著低于陽性對照組（P＜0.01），其酪氨酸酶抑制效果介于刺梨多糖和刺梨黃酮之間。處理48h后，刺梨多糖、刺梨黃酮和刺梨多酚抑制細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的IC50分別為 376.13μg·mL-1、57.51μg·mL-1、82.42μg·mL-1，其中刺梨黃酮對B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性的抑制效果最佳，且刺梨黃酮、刺梨多酚以及高濃度刺梨多糖對酪氨酸酶的抑制效果優(yōu)于維生素C。見圖2。

圖2 刺梨不同提取成分對B16細胞酪氨酸酶活性的影響Fig.2 Effects of different extraction parts of Rosa roxburghii on tyrosinase activity in B16 cells

3 討論

美白是近年來護膚品行業(yè)及消費者最熱衷追求的護膚功效之一，酪氨酸酶作為黑色素生成的限速酶，其表達和活性與黑色素合成的速度和產(chǎn)量密切相關(guān)[16]，近年來以酪氨酸酶為靶點的活性成分篩選在祛斑美白領域中的應用日益廣泛。黃少丹等[17]以酪氨酸酶為靶點對中藥美白成分進行了篩選，李紅艷等[18]通過對酪氨酸酶抑制作用的研究快速篩選出紅花中具有酪氨酸酶抑制活性的成分。近年來，無毒高效的天然植物酪氨酸酶抑制劑成為了美白化妝品及皮膚用藥的研究熱點[19]。嚴航等[20]研究發(fā)現(xiàn)，加8倍量的70%乙醇提取2h，兩次提取得到的薏苡仁提取物對酪氨酸酶活性的抑制率達33.3%，具有潛在的美白功效。王國林等[21]測定不同乙醇濃度的洗脫物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用，其中經(jīng)MCI柱后體積分數(shù)30%乙醇洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制最靈敏。本文首先通過水提法、醇提法和超聲提取法獲得刺梨多糖、黃酮和多酚，隨后研究了以上3種提取成分對黑色素瘤B16細胞增殖活性、細胞形態(tài)和酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明刺梨的3種提取物均能抑制B16細胞增殖和酪氨酸酶活性，并呈一定的濃度依賴性，其中刺梨黃酮抑制效果最佳，刺梨多酚次之，刺梨多糖效果最差。刺梨黃酮和刺梨多酚對酪氨酸酶活性的抑制程度優(yōu)于維生素C。本文的研究結(jié)果表明，刺梨多糖的提取率最高，可達45.33%，但對B16細胞增殖及酪氨酸酶活性作用效果不佳，猜測可能與多糖未經(jīng)過純化，粗提物效果不好有關(guān)，后續(xù)研究中將進一步優(yōu)選純化工藝，提純后再進行后續(xù)酪氨酸酶抑制劑篩選，以提高刺梨多糖利用率。本研究表明，與B16細胞增殖活性實驗相比，相同濃度下刺梨提取成分對細胞酪氨酸酶活性的抑制作用更強，提示刺梨黃酮和刺梨多酚可作為高效的酪氨酸酶抑制劑用于后續(xù)的產(chǎn)品開發(fā)。

黑色素瘤B16細胞作為美白產(chǎn)品的活性篩選模型，可用于美白產(chǎn)品祛斑初步功效的評價。趙京霞等[22]以B16細胞為模型，通過酶學方法研究滋補肝腎方含藥血清對細胞酪氨酸酶活性的影響。本文中以B16細胞為模型，檢測了刺梨不同提取成分對酪氨酸酶活性的影響，結(jié)果表明刺梨黃酮對B16細胞的酪氨酸酶活性具有顯著的抑制作用，作用48h時其IC50值可達57.51μg·mL-1。近年來的研究結(jié)果表明，眾多植物來源的黃酮類化學成分對酪氨酸酶具有顯著的抑制作用[23]。付小華[24]研究發(fā)現(xiàn)甘草黃酮可有效抑制酪氨酸酶單酚酶與二酚酶的活性。Nquyen等[25]研究發(fā)現(xiàn)異葉蒿黃酮能有效抑制酪氨酸酶活性，是皮膚增白劑的潛在來源。本次實驗通過醇提法提取刺梨黃酮，并用大孔樹脂純化，制備出的刺梨黃酮純度較高，為52.50%，表明優(yōu)化技術(shù)較為成熟，具有良好的開發(fā)前景，但是得率較低，后續(xù)將進一步優(yōu)化刺梨黃酮提取工藝，提高黃酮得率，為刺梨黃酮的后續(xù)開發(fā)提供研究基礎。

刺梨生長于我國云南、貴州等西南省份山區(qū)，尤以貴州資源最為豐富，是貴州的民族特色藥材，適應性強、易栽種，具有來源豐富、價格低廉的特點。我國在上世紀80年代開始就對其藥理作用進行了較為全面的研究，發(fā)現(xiàn)刺梨具有提高免疫、延緩衰老、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗癌、降血脂等功能，但是目前對于刺梨的整體開發(fā)利用程度較低[26]。本實驗為刺梨提取物，特別是刺梨黃酮的研究奠定了基礎，為化妝品行業(yè)開發(fā)新的美白原料提供了研究思路。