浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波市中醫(yī)院 寧波 315012

近年來，隨著手機(jī)應(yīng)用的日益廣泛，手機(jī)輻射對(duì)人體健康的危害日益受到人們的關(guān)注。睪丸是對(duì)電磁輻射最敏感的靶器官之一，研究顯示手機(jī)頻率的電磁輻射能夠?qū)е滦∈蟛G丸支持細(xì)胞受損，使精子發(fā)生的微環(huán)境發(fā)生改變，從而影響正常精子的發(fā)生、發(fā)育[1]。紅景天苷（salidroside）是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物紅景天的主要有效成分,除存在于紅景天中外，還存在于楊柳科植物毛柳的樹皮、木樨科植物女貞子（Ligustrum lucidum Ait）的果實(shí)中，具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等作用[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)紅景天具有良好的抗輻射效果[3]，但有關(guān)紅景天對(duì)睪丸組織輻射損傷是否具有保護(hù)作用還鮮有報(bào)道。因此，本研究原代培養(yǎng)大鼠睪丸支持細(xì)胞，模仿手機(jī)通話時(shí)的發(fā)射頻率和平均功率密度，同時(shí)以紅景天苷干預(yù)，探討手機(jī)輻射對(duì)睪丸支持細(xì)胞的損傷以及紅景天苷對(duì)睪丸支持細(xì)胞的保護(hù)作用，為深入研究紅景天苷在雄性生殖系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 熒光定量PCR儀Mx3000P型（美國(guó)Stratagene公司），普通PCR儀（德國(guó)Roche公司）,倒置顯微鏡（日本Olympus公司），CO2培養(yǎng)箱（德國(guó)Heraceu 公司），全球通系統(tǒng)數(shù)字手機(jī)（900 MHz），電磁輻射測(cè)定儀（標(biāo)智GM3120）。DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購自美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)：0781003、SH30848.01B、SV30087.03）；Ⅱ型膠原酶（批號(hào)：C5100L0041）購自上海李記生物科技有限公司；Real-time PCR Master Mix購自TaKaRa公司（批號(hào)：BK1101）；FasL抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購自北京百奧萊博科技有限公司（批號(hào)：K15463、BL0817）；CCK-8購自上海碧云天生物技術(shù)公司（批號(hào)：CZ677）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GPx）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號(hào)：20161021、20160916、20160925、20161023）；紅景天苷（純度≥97.5%）購于上海晶純生化科技股份有限公司（批號(hào)：MG0020）。

1.2 睪丸支持細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定 睪丸支持細(xì)胞分離和培養(yǎng)方法參考文獻(xiàn)[4]，睪丸支持細(xì)胞通過速差貼壁法進(jìn)行純化,采用特異FasL抗體免疫組化進(jìn)行鑒定，細(xì)胞純度=（FasL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%，純度達(dá)到90%后備用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后制備成5×104/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔體積0.2mL；另外制備2×104/mL的細(xì)胞懸液接種于24孔板，每孔體積0.5mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將細(xì)胞分成5組，對(duì)照組、輻射組、輻射+低劑量紅景天苷組、輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組，每組5孔。對(duì)照組不作任何處理，其余各組細(xì)胞上方15cm處均放置頻率為900MHz、平均功率密度為370μW·cm-3的輻射源，接受24h/d，連續(xù)5d的輻射,期間更換充電裝置，暴露參數(shù)采用標(biāo)智GM3120電磁輻射測(cè)定儀測(cè)定。同時(shí)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將配制好的紅景天苷分別加入輻射組+低劑量紅景天苷組、輻射組+中劑量紅景天苷組和輻射組+高劑量紅景天苷組中，使各組培養(yǎng)液中紅景天苷濃度分別為 100、200和 400μg·mL-1，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)5d后備用。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，各組細(xì)胞按上述方法培養(yǎng)后加入CCK-8 10μL，培養(yǎng)60min后酶標(biāo)儀450nm測(cè)定各組吸光度值。

1.4.2 紫外分光光度法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液SOD、CAT、GPx的活性和MDA的含量 細(xì)胞分組處理同前，收集24孔板內(nèi)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定SOD、CAT、GPx活性及MDA含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.3 FQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞雄激素結(jié)合蛋白（androgen binding protein，ABP）和抑制素 βB 亞基（inhibinβB，INHβB）mRNA表達(dá) 收集處理后的各組細(xì)胞，提取總RNA?？俁NA提取與cDNA合成按照試劑盒說明書操作，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。各基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。反應(yīng)體系參照說明書，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共 40 個(gè)循環(huán)，計(jì)算各組細(xì)胞中ABP和INHβB基因相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為 2-ΔΔCT。ΔCT1=對(duì)照組目的基因 CT 值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實(shí)驗(yàn)組目的基因CT值-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因 CT值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 大鼠睪丸支持細(xì)胞分離鑒定 原代睪丸支持細(xì)胞呈不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)中高表達(dá)FasL，免疫組化染色可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量棕黑色顆粒，證實(shí)為睪丸支持細(xì)胞，經(jīng)鑒定純度＞95%。見圖1。

圖1 大鼠睪丸支持細(xì)胞FasL表達(dá)（200×）Fig.1 Expression of FasL in sertoli cells(200×)

2.2 各組大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖活性比較 與對(duì)照組比較，輻射組大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖活性明顯減弱（P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中、高劑量紅景天苷組細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)（P＜0.01），增殖活性隨紅景天苷劑量增加而增加（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠睪丸支持細(xì)胞增殖活性比較Tab.2 Comparison of sertoli cell proliferation activity in each group

2.3 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，輻射組SOD、CAT和GPx活性均明顯降低，MDA含量明顯增高（均P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組SOD、CAT和GPX活性均有不同程度升高，MDA含量則顯著降低（P＜0.01或P＜0.05）。中、高劑量紅景天苷組細(xì)胞中SOD、CAT和GPx活性隨紅景天苷劑量增加而增加，MDA含量則隨紅景天苷劑量增加而降低（均P＜0.01）。見表 3。

表3 各組細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of cell oxidative stress indexes in each group

2.4 各組細(xì)胞ABP和INHβB mRNA表達(dá)比較與對(duì)照組比較，輻射組ABP和INHβB mRNA表達(dá)量明顯減少（均P＜0.01）。與輻射組比較，輻射+中劑量紅景天苷組和輻射+高劑量紅景天苷組ABP和INHβB mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增高（P＜0.05或P＜0.01）。中、高劑量紅景天苷組睪丸支持細(xì)胞ABP和INHβB mRNA相對(duì)表達(dá)量隨紅景天苷濃度增加而增加（均 P＜0.01）。見表 4。

表4 各組細(xì)胞ABP和INHβB基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Tab.4 The mRNA relative expression of ABP and INHβB in each group

3 討論

當(dāng)前，電磁技術(shù)的廣泛應(yīng)用為人類的學(xué)習(xí)、生活和工作帶來諸多便利，同時(shí)也造成了環(huán)境的電磁污染，威脅人類的健康。生殖系統(tǒng)是對(duì)電磁輻射敏感的靶器官，持續(xù)電磁輻射可導(dǎo)致精液質(zhì)量下降、睪丸氧化損傷，曲細(xì)精管的生精上皮變薄，支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞不同程度變性，最終可導(dǎo)致不育癥[5-6]。睪丸支持細(xì)胞在生精小管內(nèi)為精子的發(fā)生發(fā)育提供保護(hù)和多種必要物質(zhì)。INH是卵泡刺激素與其受體結(jié)合后，睪丸支持細(xì)胞特異性分泌的一種糖蛋白激素，對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸中卵泡刺激素的產(chǎn)生起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。INH有兩種形式：INH A（αβA）和INH B（αβB），男性體內(nèi)主要為INH B。研究表明，INH B與精子發(fā)生有密切關(guān)系，其血清濃度降低常預(yù)示存在生精功能障礙，是目前已知的評(píng)價(jià)男性精子發(fā)生最好的內(nèi)分泌標(biāo)志物[7]。ABP是由睪丸支持細(xì)胞分泌的一種載體蛋白，對(duì)雄激素有高度親和力,ABP的存在使曲細(xì)精管管腔內(nèi)的雄激素水平維持穩(wěn)定，為精子的分化和成熟提供保障。ABP分泌異?？蓪?dǎo)致曲細(xì)精管管腔內(nèi)的雄激素水平異常，影響精子的分化和成熟[8]。本研究顯示，手機(jī)電磁輻射可引起睪丸支持細(xì)胞分泌ABP和INH βB降低，這可能是手機(jī)電磁輻射導(dǎo)致男性精液質(zhì)量下降的原因之一。另外，多項(xiàng)研究表明手機(jī)電磁輻射能造成氧化損傷，影響精子質(zhì)量[5-9]，而本研究也發(fā)現(xiàn)手機(jī)電磁輻射亦能使大鼠睪丸支持細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量升高，抗氧化酶SOD、CAT和GPx活性降低，提示手機(jī)電磁輻射能影響睪丸支持細(xì)胞抗氧化酶類活性，并造成睪丸支持細(xì)胞脂質(zhì)損傷，與既往研究報(bào)道一致。

紅景天屬為多年生草本或亞灌木植物，我國(guó)有73種，其中大花紅景天產(chǎn)于海拔2 800～5 600m的高寒、缺氧、強(qiáng)紫外線照射的西藏地區(qū)，因紅景天苷含量豐富穩(wěn)定被中國(guó)藥典收錄。紅景天具有益氣活血、通脈平喘的功效，用于氣虛血瘀、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、倦怠氣喘。紅景天能改善機(jī)體的適應(yīng)性，能提高機(jī)體對(duì)抗各種化學(xué)、生物或物理因素刺激的能力，使紊亂的機(jī)能得到恢復(fù)，即“適應(yīng)原樣”作用[10-11]。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究表明紅景天苷還具有抗缺氧、抗癌、抗抑郁、抗焦慮、抗炎以及抗氧化等多種功能[2]。近來研究表明紅景天苷具有良好的抗輻射功效，能有效對(duì)抗紫外線、X射線及60Coγ射線對(duì)機(jī)體造成的損害[3,12]。本研究結(jié)果顯示，紅景天苷可抑制手機(jī)電磁輻射對(duì)睪丸支持細(xì)胞分泌功能的損害，說明紅景天苷能對(duì)抗手機(jī)輻射對(duì)睪丸支持細(xì)胞造成的損傷，進(jìn)而有助于精子的發(fā)生和發(fā)育。另外研究表明紅景天苷具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能有效清除機(jī)體運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生的自由基[13]，而本研究中紅景天苷能有效提高睪丸支持細(xì)胞SOD、CAT和GPx活性，對(duì)抗手機(jī)輻射引起的抗氧化酶活性降低，從而減輕氧化應(yīng)激造成的睪丸支持細(xì)胞損傷，提示紅景天苷在睪丸組織同樣具有抗氧化功效。

雄性生殖系統(tǒng)對(duì)輻射損傷極為敏感，而紅景天具有“適應(yīng)原樣”作用，抗輻射功效明顯，因此紅景天在治療雄性生殖系統(tǒng)輻射損傷方面具有較高的潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)手機(jī)電磁輻射造成的睪丸支持細(xì)胞氧化受損具有保護(hù)作用，并對(duì)睪丸支持細(xì)胞蛋白分泌功能的恢復(fù)具有促進(jìn)作用，為紅景天在傳統(tǒng)中醫(yī)男科治療電磁輻射損傷方面的應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但輻射損傷對(duì)睪丸功能的損害是多方面的，如精子的營(yíng)養(yǎng)、免疫因子的分泌、血睪屏障的構(gòu)建等，因此紅景天苷在雄性生殖系統(tǒng)輻射損傷中的作用有待進(jìn)一步深入研究。