劉婷婷 楊發(fā)燈 林志淼 汪慧君 胡凌寒 鐘偉龍 楊勇

100034北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科

先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病（autosomal recessive congenital ichthyosis，ARCI）是臨床上表現(xiàn)為全身皮膚鱗屑為特征的一組具有異質(zhì)性的皮膚疾病。主要分為板層狀魚鱗病（lamellar ichthyosis，LI）、先天性魚鱗病樣紅皮病（congenital ichthyosiform erythroderma，CIE）、丑角樣魚鱗?。╤arlequin ichth?yosis，HI）三種亞型［1］。板層狀魚鱗病主要臨床特征是大片深灰或棕色鱗屑、角化過度，無或輕度紅皮病，而先天性魚鱗病樣紅皮病表現(xiàn)為廣泛分布小的白色鱗屑和程度不等的紅皮病。丑角樣魚鱗病癥狀最嚴(yán)重，出生時(shí)新生兒全身緊密包裹膠樣膜、亮紅色滲血的皮膚裂口和皸裂、嚴(yán)重的瞼外翻、唇外翻和耳部畸形，一般早產(chǎn)或出生后數(shù)日或數(shù)周內(nèi)死亡。目前已證實(shí)的致病基因包括：TGM1、ALOX12B、ALOXE3、ABCA12、CYP4F2、NIPAL4、SDR9C7、LIPN、CERS3、PNPLA1、ST14、CASP14、ABHD5、SLC27A4、SULT2B1［1?5］，其中ABCA12 突變較少，約占5%［6］。ABCA12基因突變的病例主要集中在非洲、歐洲以及日本等地區(qū)，而我國(guó)相關(guān)報(bào)道較少。我們?cè)谂R床中收集了兩個(gè)ABCA12基因復(fù)合雜合突變的ARCI家系，進(jìn)一步探究ABCA12基因突變與臨床表型之間的聯(lián)系。

資料和方法

1.臨床資料：例1，男，23歲，出生時(shí)身體廣泛發(fā)紅伴火棉膠樣改變，之后全身漸脫屑。體檢：軀干、四肢及面部輕微紅皮病癥狀伴白色細(xì)小鱗屑，雙手屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化（圖1A），診斷：輕型CIE。例2，女，30歲，早產(chǎn)，出生時(shí)全身皮膚發(fā)紅、緊繃，伴瞼外翻，后全身皮膚角化、脫屑，手指屈曲伴輕度攣縮。體檢：全身廣泛發(fā)紅，游離片狀白色鱗屑，雙眼瞼外翻，瘢痕性禿發(fā)，手指屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化（圖1B），診斷：重型CIE。2例患者的父母均否認(rèn)近親婚配，否認(rèn)家族有類似病史。

圖1 先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病患者臨床特征 1A：例1腹部及大腿輕微紅皮癥狀伴白色細(xì)小鱗屑，手指屈曲伴輕度攣縮，皸裂性掌跖角化；1B：例2面部紅斑、眼瞼外翻、瘢痕性禿發(fā)，背部游離片狀白色鱗屑，皸裂性掌跖角化，手指屈曲伴輕度攣縮

2.基因組DNA提?。航?jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)2例患者父母簽署知情同意書。分別取2例患者及其父母外周血2 ml，使用全基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA。

3.基因芯片篩選可疑突變基因及位點(diǎn)：先使用Covaris打斷法將樣品DNA打碎至100～700 bp片段，再進(jìn)行末端修復(fù)，加“A”及產(chǎn)物純化，最后進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增PCR和質(zhì)檢，建庫(kù)成功。經(jīng)過生物素標(biāo)記的探針（北京邁基諾基因科技股份有限公司）與文庫(kù)DNA在一定條件下雜交，用鏈霉親和素修飾的磁珠共價(jià)結(jié)合生物素標(biāo)記的探針，抓取目的基因，用磁力架吸附攜帶目的基因的磁珠洗脫純化，富集目的基因，再應(yīng)用NextSeq 500高通量測(cè)序儀（美國(guó)Illumina公司）測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和去除銜接子、低質(zhì)量reads（測(cè)序片段）及短序列（＜40 bp）等預(yù)處理，BWA比對(duì)軟件將預(yù)處理后數(shù)據(jù)與人基因組（hg19）比對(duì)，再用GATK的Realigner Target Creator和Indel Realigner工具對(duì)Indel區(qū)域的reads重新做局部多序列比對(duì)，對(duì)堿基質(zhì)量值經(jīng)過矯正后，使用GATK的Haplotype Caller來檢測(cè)SNP和INDEL。將得到的序列結(jié)果在數(shù)據(jù)庫(kù)（包括千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、ESP6500、inhouse、外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)）中比對(duì)，對(duì)可疑的致病基因及突變位點(diǎn)進(jìn)行篩選、標(biāo)注，最后嚴(yán)格按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（ACMG）指南進(jìn)行致病性分析，找到可疑致病基因及突變位點(diǎn)。另外在分析中使用SIFT、Polyphen?2及Mutation Taster等軟件進(jìn)行功能預(yù)測(cè)。

4.Sanger法驗(yàn)證：通過primer blast網(wǎng)站，在ABCA12基因各個(gè)突變位點(diǎn)所在外顯子的上下游設(shè)計(jì)引物，第21號(hào)外顯子上游5′-GCATAACGACCCA TTTTCTTTGG-3′，下游5′-TGGTTGCCTACATGAAA GGTTCT-3′；47號(hào)外顯子上游5′-ATCAAAGTCACT GACCACCATGA-3′，下游 5′-CACGGGCCAAGGAG TTTCTAA-3′；42號(hào)外顯子上游5′-CTACTTGGTGC CTGTAGCGT-3′，下游5′-AGTCCTATTTGTGTCTAG GGGC-3′；50號(hào)外顯子上游5′-TGCTCATGAACTTC AACCCAAG-3′，下游5′-TCCTTGAATCTGAGTGAG CACC-3′，引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，2例患者及其父母的DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，再用Sanger測(cè)序法進(jìn)行雙向測(cè)序（ABI3730xl測(cè)序儀，天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司）。測(cè)序結(jié)果包括目的外顯子所有序列及兩側(cè)至少30 bp側(cè)翼序列，純化后的測(cè)序結(jié)果與Ensembl genome browse 90所公布的序列雙向?qū)Ρ取?/p>

結(jié) 果

例1在ABCA12基因的21和47號(hào)外顯子分別出現(xiàn)c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）復(fù)合雜合錯(cuò)義突變（圖2A），其中c.2759A＞G突變來自母親，c.7004A＞G突變來自父親。例2ABCA12基因在42號(hào)外顯子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）雜合移碼突變，50號(hào)外顯子存在c.7406G＞A（p.C2469Y）雜合錯(cuò)義突變（圖2B），其母親攜帶c.6163_6164insT突變，其父親攜帶c.7406G＞A突變。使用SIFT，Polyphen?2及Mutation Taster軟件對(duì)上述3個(gè)錯(cuò)義突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，結(jié)果均顯示其可能的致病作用，另外1個(gè)移碼突變c.6163_6164insT編碼的截?cái)嗟鞍滓部赡苡绊懙鞍踪|(zhì)功能（表1）。

圖2 2例先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病ABCA12基因測(cè)序結(jié)果及突變位點(diǎn) 例1在21和47號(hào)外顯子出現(xiàn)c.2759A＞G（p.N920S）和c.7004A＞G（p.Y2335C）復(fù)合雜合錯(cuò)義突變；例2在42和50號(hào)外顯子存在c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）雜合移碼突變和c.7406G＞A（p.C2469Y）雜合錯(cuò)義突變

圖3 ABCA12蛋白結(jié)構(gòu)［8］及患者的突變位點(diǎn) p.N920S位于N末端區(qū)域；p.Y2335C和p.C2469Y位于第2個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域；p.K2057Qfs*8位于第2個(gè)跨膜區(qū)域中2和3號(hào)螺旋跨膜區(qū)之間。黑色的p.Y2335C、p.C2469Y已被報(bào)道，紅色的p.N920S、p.K2057Qfs*8為新突變

表1 兩個(gè)先天性常染色體隱性遺傳性魚鱗病家系A(chǔ)BCA12基因突變功能預(yù)測(cè)

討 論

根據(jù)臨床表現(xiàn)不同，ARCI可以分為三個(gè)亞型，但不同亞型患者表型會(huì)有一定重疊。即使同一亞型，ARCI隨病程發(fā)展也會(huì)表現(xiàn)出不同程度的變化。本文2例患者，盡管都診斷為CIE，但除了具有相同的手指屈曲伴輕度攣縮、皸裂性掌跖角化特征外，例2在紅皮病程度、鱗屑的形態(tài)和大小上比例1表現(xiàn)得更嚴(yán)重，而且還伴雙眼瞼外翻、瘢痕性禿發(fā)。因此，例1和例2分別診斷為輕型CIE和重型CIE。

ABCA12基因位于2號(hào)染色體（2q34），是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子超家族成員，可編碼一種主要在角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCA12蛋白主要由兩個(gè)高度保守的核苷酸結(jié)合區(qū)域、兩個(gè)保守的跨膜區(qū)域組成。核苷酸結(jié)合區(qū)域位于細(xì)胞內(nèi)，包含Walker A、Walker B、Q、D、H-loop、ATP結(jié)合位點(diǎn)等元件，而每個(gè)跨膜區(qū)域由6個(gè)螺旋跨膜區(qū)組成［7］（圖3）。ABCA12蛋白可利用ATP來轉(zhuǎn)運(yùn)包含神經(jīng)酰胺在內(nèi)的脂質(zhì)通過細(xì)胞膜［8］，在顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞中高爾基體向板層小體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和表皮分化過程中發(fā)揮重要作用［9］。故該基因功能缺陷會(huì)導(dǎo)致板層小體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙且降低顆粒層細(xì)胞間的脂質(zhì)水平［10］。迄今，在外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)可發(fā)現(xiàn)100多個(gè)ABCA12基因突變，且不同位點(diǎn)ABCA12基因突變會(huì)引起不同程度的表型［11］。移碼突變、無義突變、剪接突變及片段插入缺失的突變都會(huì)編碼截?cái)嗟鞍咨踔镣耆淖儼被嵝蛄?，從而?yán)重地影響蛋白功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的HI。純合或復(fù)合雜合錯(cuò)義突變對(duì)蛋白功能干擾比較小，一般只會(huì)引起不同癥狀的LI和CIE。在ABCA12基因突變中，超過93%會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的HI，只有5%～7%引起癥狀較輕的LI或CIE［1,12］。ABCA12基因突變與患者臨床表型具有緊密聯(lián)系，可通過研究ABCA12基因突變?yōu)锳RCI患者及家庭提供遺傳咨詢。

本研究中，c.7004A＞G和c.7406G＞A已被報(bào)道與ARCI相關(guān)［7，11］，而c.2759A＞G、c.6163_6164insT在千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)和外顯子組整合聯(lián)合數(shù)據(jù)庫(kù)均未檢到，為新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。p.Y2335C和p.C2469Y分別位于高度保守的第2個(gè)ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域中ATP結(jié)合位點(diǎn)附近和末端部位，突變可能會(huì)干擾ATP結(jié)合。例1家系中發(fā)現(xiàn)，新突變位點(diǎn)c.2759A ＞ G（p.N920S）在UniProt與天冬酰胺N-連接糖基化修飾位點(diǎn)相關(guān)，當(dāng)?shù)?20位天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸時(shí)，使N-連接糖基化消失，可能會(huì)干擾ABCA12蛋白信號(hào)傳導(dǎo)或正確折疊［13］，p.N920S很可能對(duì)ABCA12蛋白正常結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生一定影響。復(fù)合雜合錯(cuò)義突變p.N920S和p.Y2335C使例1出現(xiàn)比較典型的火棉膠嬰兒，軀干、四肢及面部輕微紅皮病癥狀伴白色細(xì)小鱗屑、皸裂性掌跖角化、手指屈曲伴輕度攣縮等特征，臨床診斷為輕型CIE。例2家系中，新突變p.K2057Qfs*8位于第2個(gè)跨膜區(qū)域的2和3號(hào)螺旋跨膜區(qū)之間，其編碼的截?cái)嗟鞍滓蛉鄙俨糠职被崞危瑫?huì)破壞ABCA12蛋白的完整性，突變功能預(yù)測(cè)得分1.000（Mutation Taster），其必然不利于正常蛋白功能。潘瓊等［14］報(bào)道的1例HI中移碼突變c.6167_6168insT（p.F2056Ffs*9）與本研究的c.6163_6164insT（p.K2057Qfs*8）作用相似，都可能較嚴(yán)重地影響該蛋白功能，但HI患者的另一個(gè)無義突變c.3673C＞T（p.R1225*）位于第25號(hào)外顯子，使第1225位氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，即ABCA12蛋白的2個(gè)核苷酸結(jié)合區(qū)域和第2個(gè)跨膜區(qū)域完全缺失，它對(duì)ABCA12蛋白功能的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于例2的錯(cuò)義突變c.7406G＞A（p.C2469Y），所以移碼突變 c.6167_6168insT（p.K2057Qfs*8）和無義突變 c.3673C＞T（p.R1225*）可能導(dǎo)致具有致死性的HI亞型［14］。本研究中的例2與例1相比可證明移碼突變帶來的影響比錯(cuò)義突變更嚴(yán)重，與已報(bào)道HI患者相比可證明無義突變具有更大危害性。不同ABCA12基因突變和ARCI臨床表型具有緊密關(guān)聯(lián)。

總之，本文確定了2個(gè)ARCI相關(guān)的ABCA12基因新突變c.2759A＞G和c.6163_6164insT，首先報(bào)道了天冬酰胺N-連接糖基化修飾位點(diǎn)相關(guān)的突變，分析了不同突變可導(dǎo)致不同的表型。對(duì)進(jìn)一步明確ABCA12基因突變與ARCI臨床表型之間的聯(lián)系具有一定的意義，并且為這2個(gè)ABCA12基因突變相關(guān)ARCI患者及家庭的遺傳咨詢奠定了基礎(chǔ)。