劉瑞風 楊曉紅 梁見楠 張開明

030009太原市中心醫(yī)院皮膚科

銀屑病是一種常見的慢性復(fù)發(fā)性炎癥性皮膚病，嚴重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。因此，探究其發(fā)病原因及尋找有效治療靶點非常重要。研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）細胞因子分泌、免疫調(diào)節(jié)功能及基因表達均有異常［1?4］。環(huán)狀RNA分子（circRNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類新的非編碼調(diào)控RNA，已證實其參與許多生物學(xué)過程和人類疾?。??6］。我們用RNA測序法檢測銀屑病患者皮損及健康對照皮膚MSC中circRNA表達，并進行詳細的生物信息學(xué)分析，從分子水平探討circRNA在銀屑病發(fā)病中的作用。

材料和方法

一、對象與材料

1.研究對象：本研究經(jīng)太原市中心醫(yī)院倫理委員會批準（2014010），所有受試對象均簽署知情同意書。銀屑病患者組15例，男8例，女7例；進行期7例，靜止期8例；年齡13～65歲，病程10 d至20年；皮損范圍5%～80%，均為太原市中心醫(yī)院皮膚科臨床及病理確診為尋常性銀屑病的門診患者，就診前6個月內(nèi)局部及全身未使用過糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥物、免疫抑制劑及光療。所有患者均依據(jù)銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(shù)（PASI）評估，PASI分值10.33±3.26（范圍1.8～15.0）。對照組15例，取自我院泌尿外科和整形外科手術(shù)切除的正常皮膚，性別、年齡與患者組1∶1匹配（年齡±2歲），經(jīng)常規(guī)體檢無系統(tǒng)性疾病，入選時禁用藥條件同患者組。

2.主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Hyclone公司），Dispase酶Ⅱ、胰蛋白酶、堿性成纖維細胞生長因子及B27添加劑（美國Sigma公司），circRNA富集試劑盒（上海云序生物科技有限公司），總RNA文庫預(yù)處理試劑盒（美國Illumina公司），Trizol、SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶（美國Invitrogen公司），EPICS?XL型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；BioAnalyzer 2100儀器（美國Agilent公司）；ViiA 7實時PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）。

二、方法

1.皮膚MSC的分離、培養(yǎng)及鑒定：切取銀屑病患者1.5 cm×1 cm皮損，健康對照組取同樣大小的正常皮膚。皮膚MSC的分離、培養(yǎng)及流式鑒定方法同文獻［1?2］。倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，細胞生長近90%融合狀態(tài)時用0.25%胰酶消化傳代。細胞傳至第5代，收獲細胞，分別取2×105個細胞與異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA?DR單克隆抗體室溫避光反應(yīng)30 min，用PBS洗滌后進行流式細胞儀分析、鑒定。

第5代MSC分別用脂肪、骨及軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)。脂肪細胞分化10 d后，用4%甲醛固定，60%異丙醇洗滌，并用油紅O染色。成骨分化3周后，用4%甲醛固定細胞并用2%茜素紅染色。成軟骨分化21 d后，4%多聚甲醛固定，OCT包埋，切成5 μm切片，甲苯胺藍染色。

2.RNA文庫的制備及測序：每組15例標本隨機分為3個亞組，每亞組5個標本，進行circRNA測序。使用每個亞組的總RNA制備circRNA文庫，包括以下步驟：提取總RNA 5 μg，使用circRNA富集試劑盒富集circRNA；使用TruSeq Stranded總RNA文庫預(yù)處理試劑盒預(yù)處理RNA，構(gòu)建測序文庫；使用BioAnalyzer 2100儀器進行文庫質(zhì)控和定量。根據(jù)Illumina測序說明，將文庫變性為單鏈DNA分子，在Illumina流動池上捕獲，原位擴增為簇，并在Illumina HiSeq測序儀上進行150循環(huán)測序。circRNA測序由上海云序生物科技有限公司完成。

3.測序數(shù)據(jù)分析：經(jīng)過Illumina HiSeq測序儀測序，使用CIRI軟件［7］進行circRNA檢測和鑒定，并使用circBase數(shù)據(jù)庫［8］對所鑒定的circRNA進行注釋，對數(shù)據(jù)進行標準化，使用t檢驗進行兩組樣品的差異circRNA鑒定，通過倍數(shù)變化和P值進行篩選，選擇差異倍數(shù) ≥2，P＜0.05的circRNA作為差異circRNA。對差異circRNA的來源基因進行GO功能分析和KEGG通路分析，并使用microRNA靶基因預(yù)測 軟 件 TargetScan 和 miRanda［9?10］進 行 circRNA ?microRNA相互作用預(yù)測。

4.對挑選的差異circRNA注釋和功能預(yù)測：挑選7個差異較大的circRNA構(gòu)建circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)并進行生物信息學(xué)分析。

5.實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT?PCR）驗證circRNA及microRNA的表達：對上述網(wǎng)絡(luò)中的7個circRNA分子，以GAPDH作為內(nèi)參，使用ViiA 7實時PCR系統(tǒng)進行qRT?PCR驗證。用Trizol試劑分別提取30例樣本（銀屑病皮損和正常皮膚MSC各15例）總RNA，用SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。從circBase數(shù)據(jù)庫得到circRNA序列。引物序列見表1。數(shù)據(jù)采用2?△△Ct方法分析，以±s表示。

為了驗證circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)中microRNA的表達，根據(jù)與這7個circRNA結(jié)合位點的數(shù)量，挑選了3個結(jié)合位點數(shù)量最多的microRNA（hsa?miR?4490，hsa?miR?654?3p和hsa?miR?423?5p）進行qRT?PCR分析。管家基因U6作為內(nèi)參，基因表達變化采用 2?ΔΔCt計算。ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參；ΔΔCt= ΔCt患者組- ΔCt對照組。引物序列見表2。

表1 circRNA引物序列

表2 microRNA引物序列

三、統(tǒng)計學(xué)方法

分位數(shù)歸一化和后續(xù)的數(shù)據(jù)處理使用R軟件包>進行（ttps：//www.r?project.org/）。所有其他統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0軟件分析。患者組和對照組qRT?PCR驗證采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、皮膚MSC的培養(yǎng)和鑒定

流式細胞儀分析結(jié)果顯示，患者組和對照組皮膚MSC表面抗原均高表達CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，而 CD34、CD45 及HLA?DR表達陰性（圖1）。經(jīng)成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)后，皮膚MSC成功分化為相應(yīng)的細胞和組織（圖2），分離培養(yǎng)的細胞符合MSC的鑒定標準［11］。

二、皮膚MSC的circRNA表達譜

共檢測到6 323個circRNA，其來源基因的染色體位置分別為：外顯子（3 881，61%），內(nèi)含子（554，9%），正義鏈重疊區(qū)（1 035，16%），反義鏈（747，12%），基因間隔（106，2%），見圖 3A。在這些circRNA中，circBase數(shù)據(jù)庫中包含2 810個；286個以往被研究者報道過，但不包含在circBase數(shù)據(jù)庫中；3 227個以往沒有被報道過，是首次發(fā)現(xiàn)。另外，在6 323個circRNA中，3 499個僅在銀屑病皮損中表達，而1 385個僅在正常皮膚中表達，只有1 439個在兩者中均有表達，見圖3B。

根據(jù)變化倍數(shù)（≥2.0）和t檢驗結(jié)果（P ＜0.05），共鑒定出129個差異表達circRNA。與對照組相比，患者組中123個表達上調(diào)，6個表達下調(diào)。火山圖（圖3C）和聚類圖（圖3D）顯示出兩組間circRNA表達的差異。CircRNA測序數(shù)據(jù)已上傳到美國國家生物技術(shù)信息中心基因表達數(shù)據(jù)庫（GSE81106）。

三、circRNA預(yù)測和注釋

挑選7個表達差異較大的circRNA，通過microRNA靶基因預(yù)測軟件進行差異circRNA?microRNA相互作用預(yù)測，它們與microRNA的相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖4。與這7個差異circRNA關(guān)系密切的銀屑病相關(guān)microRNA包括，miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p等，它們之間存在相互作用。

四、qRT?PCR驗證結(jié)果

皮膚MSC來源的7個circRNA均在患者組高表達（圖5A），與RNA測序結(jié)果一致。其中，僅chr14：50053483|50329358和 chr5：170610199|170632616在兩組中的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.182、7.615，P=0.033、0.001）。根據(jù)預(yù)測的 circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，挑選與這7個circRNA結(jié)合位點數(shù)量最多的3個microRNA，結(jié)合位點數(shù)量見圖5B。隨后，采用qRT?PCR方法檢測了患者組及對照組各15例標本中3個microRNA的表達，證實這3個microRNA在皮膚MSC中存在，并發(fā)現(xiàn)它們在銀屑病皮損中低表達（t=3.993、3.217、2.918，P=0.016、0.032、0.043），見圖5C。

圖4 circRNA注釋與功能預(yù)測 7個差異表達的circRNA與microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)，黃色圓圈代表circRNA，綠色三角形代表microRNA

討 論

circRNA是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的一類新型非編碼調(diào)控RNA。它們表達豐富，在進化上高度保守，具有組織和/或發(fā)育階段特異性［5］，可以與RNA相關(guān)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄；且富含microRNA結(jié)合位點，在細胞中起到microRNA海綿的作用［12］，進而解除microRNA對其靶基因的抑制作用［13?14］，提高靶基因的表達水平，這一作用機制被稱為競爭性內(nèi)源RNA機制。通過與疾病關(guān)聯(lián)的microRNA相互作用，circRNA在疾病中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

圖5 qRT?PCR驗證circRNA及microRNA 5A：7個差異表達的circRNA測序及PCR驗證圖；5B：每個circRNA上microRNA結(jié)合位點的數(shù)量；5C：circRNA?microRNA互作網(wǎng)絡(luò)中挑選的3個microRNA的PCR驗證結(jié)果，a：P＜0.05。每組均為15份標本

我們發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損MSC circRNA表達異常，并報告了3 227個新的circRNA。我們共檢測到6 323個circRNA，其中大部分來自外顯子（61%），與以往報告的結(jié)果一致［12］?；颊呓M與對照組相比，有129個circRNA呈差異表達。為了揭示這些circRNA的作用，在這些差異表達的circRNA中挑選了7個差異倍數(shù)較大的circRNA構(gòu)建了circRNA?microRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。此網(wǎng)絡(luò)圖表明，這些circRNA與以下microRNA關(guān)系密切，包括miR?17?5p、miR?30e?5p、miR?142?3p/5p、miR?369?3p、miR?184、miR?4490、miR?654?3p和miR?423?5p。值得一提的是，已有文獻報道m(xù)iR?17?5p、miR?30e?5p和miR?142?3p/5p在銀屑病皮損中差異表達，且miR?142?3p明確參與表皮的炎癥［15］；銀屑病患者血清和皮損中的miR?369?3p表達均升高，在皮損中的水平與疾病嚴重程度呈正相關(guān)［16］。此外，miR?184在銀屑病皮損中表達上調(diào)，并直接影響其他microRNA的表達，可能在角質(zhì)形成細胞相關(guān)疾病中發(fā)揮獨特的作用［17］。以上結(jié)果均提示，circRNA可能通過吸附這些與銀屑病相關(guān)的microRNA從而解除其對靶基因的抑制作用，使靶基因表達升高，進一步參與銀屑病的發(fā)病。為了證實這些microRNA的真實存在，我們挑選其中3個采用qRT?PCR進行驗證，結(jié)果表明，它們不但在皮膚中存在，而且在銀屑病患者皮損表達異常（圖5C）。

本研究結(jié)果證實，銀屑病皮損MSC的circRNA表達異常。通過詳細的生物信息學(xué)分析，我們認為circRNA參與了銀屑病的發(fā)病。本研究結(jié)果及進一步的分子機制深入探討將為銀屑病發(fā)病機理研究及尋找新的治療靶點提供新思路。本課題只研究了皮膚MSC的circRNA表達，沒有研究這些寡核苷酸在角質(zhì)形成細胞及免疫細胞中的表達，并且沒有進入深入的機理分析。我們目前正在進行更廣泛和深入的研究，來闡明circRNA在銀屑病發(fā)病中的作用。