查樹偉 許豪勤 呂年青 查佶 周定杰 傅雅麗 石慧 鄒文霓 孫慶 張偉婧

目前，中國人群攜帶突變耳聾基因的比例約為12%，每1 000個新生兒中就有2～3名聾兒，其中一半以上是由耳聾基因突變導(dǎo)致的遺傳性耳聾[1]。如果進(jìn)行科學(xué)的干預(yù)和指導(dǎo)，可以幫助這些家庭減少生育(再生育)聾兒的風(fēng)險。本文就孕前耳聾基因篩查項目對聾人家庭及高危夫婦耳聾基因篩查進(jìn)行了分析和生育指導(dǎo)。

對象與方法

一、對象

選取2014年6月—2015年8月在江蘇省的鎮(zhèn)江、泰興、如皋、高郵、漣水和沭陽6個項目點(diǎn)進(jìn)行耳聾基因篩查項目檢測的孕前耳聾基因高危人群[2]以及已生育的子女1 203例。入選標(biāo)準(zhǔn)為本人聽力檢測有聽力損失和(或)家族成員有耳聾患者，即耳聾基因高危人群。篩查檢測對象分為聾人904例和非聾人299例，包含聾人家庭中父母和1個子女(31個聾人家庭共93例)、父母和2個子女(5個聾人家庭共20例)以及耳聾基因高危人群夫婦(夫婦共108對216例)生育(再生育)分析以及夫婦僅一方為耳聾基因高危人群等(874例)研究對象的耳聾基因突變類型。

二、方法

1.標(biāo)本采集：對確定耳聾基因篩查的人群收集標(biāo)本，相對集中實施標(biāo)本的采集，便于標(biāo)本的集中寄送。采集靜脈血2～3 ml，采血者不需要空腹，血樣標(biāo)本使用抗凝劑為EDTA或枸櫞酸鈉的真空塑料采血管。全血在生物冰袋條件下運(yùn)輸，并在12 h內(nèi)送達(dá)實驗室，-20 ℃保存，盡量新鮮血液進(jìn)行DNA提取。

2.芯片檢測：采用遺傳性耳聾基因芯片檢測試劑盒(博奧生物有限公司)對GJB2(35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT)、GJB3(538 C>T)、SLC26A4(2168 A>G、IVS7-2 A>G)和線粒體DNA 12S rRNA(1494 C>T、1555 A>G)4個耳聾相關(guān)基因的9個致聾突變位點(diǎn)，按照實驗操作流程[3]進(jìn)行檢測和結(jié)果判讀。

3.聽力測試：采用語聲測試法，按WHO聽力損失的標(biāo)準(zhǔn)[4]評估聽力。

4.統(tǒng)計學(xué)處理：采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)。統(tǒng)計方法包括統(tǒng)計學(xué)描述，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高危人群中聾人和非聾人篩查檢測結(jié)果比較

在1 203例耳聾基因高危人群中，其中男性599例(49.8%)，平均年齡(25.5±13.5)歲；女性604例(50.2%)，平均年齡(26.7±12.5)歲。通過語聲測試法評估高危人群聽力，其中聾人904例(75.1%)、非聾人299(24.9%)。

經(jīng)芯片檢測，高危人群耳聾基因突變總攜帶率為48.2%(580/1 203)，其中聾人耳聾基因突變總攜帶率為48.0%(434/904)，非聾人為48.8%(146/299)，兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表1中陽性表示耳聾基因芯片檢測結(jié)果存在純合(均質(zhì))耳聾基因突變、或復(fù)合耳聾基因突變、或雜合(異質(zhì))耳聾基因突變，陰性表示耳聾基因芯片檢測結(jié)果9個位點(diǎn)均為野生型。聾人和非聾人單一位點(diǎn)陽性的4個基因型構(gòu)成比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 高危人群中聾人和非聾人的耳聾基因突變率和基因型構(gòu)成比情況[例(%)]

*P<0.05

二、聾人家庭中父母和1個子女的篩查檢測結(jié)果

在31個有聾人的家庭中父親、母親和1個子女同時進(jìn)行耳聾基因篩查，篩查檢測結(jié)果的家庭耳聾基因突變類型有21種，見表2。表中的35 del G、176 del 16、235 del C、299 del AT、538 C>T、2168 A>G、IVS7-2 A>G、1494 C>T和1555 A>G分別表示芯片檢測的9個位點(diǎn)，9個位點(diǎn)野生型(wildtype at all nine loci)可認(rèn)為正常，純合(homozygous)、雜合(heterozygous)、均質(zhì)(homoplasmic)和異質(zhì)(heteroplasmic)分別表示該位點(diǎn)存在的耳聾基因純合突變、雜合突變、均質(zhì)突變和異質(zhì)突變，其他位點(diǎn)為野生型。

三、聾人家庭中父母和2個子女的篩查檢測結(jié)果

在5個有聾人的家庭中父親、母親和2個子女同時進(jìn)行耳聾基因篩查，檢測的家庭耳聾基因突變類型見表3。

表2 父母和1個子女家庭檢測的耳聾基因突變類型

Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation

表3 父母和2個子女家庭檢測的耳聾基因突變類型

Note: 9 [○] represents wildtype at all nine loci; [∽] represents heterozygous mutation; [∞] represents homozygous mutation; [●] represents homoplasmic mutation

四、高危人群夫婦的篩查檢測結(jié)果

耳聾基因篩查高危人群中同時檢測夫(男方)婦(女方)雙方共108對，夫婦耳聾基因突變有48種組合，合并為11種耳聾基因突變類型：

(1)夫婦的一方為9個位點(diǎn)均為野生型，另一方為單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-01)，共17例4種組合(176 del 16雜合1例，235 del C雜合9例，299 del AT雜合1例，IVS7-2 A>G雜合6例)。

(2)夫婦的一方為9個位點(diǎn)均為野生型，另一方為單一位點(diǎn)純合突變(類型編號3-02)，共9例4種組合(176 del 16純合1例，235 del C純合5例，299 del AT純合2例，IVS7-2 A>G純合1例)。

(3)夫婦的一方為9個位點(diǎn)均為野生型，另一方為兩個位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-03)，共9例6種組合(176 del 16雜合235 del C雜合2例，176 del 16雜合299 del AT雜合1例，235 del C雜合299 del AT雜合2例，235 del C雜合2168 A>G雜合1例，235 del C雜合IVS7-2 A>G純合1例，2168 A>G雜合IVS7-2 A>G雜合2例)。

(4)夫婦雙方都是單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-04)，共26例11種組合(176 del 16雜合與235 del C雜合1例，176 del 16雜合與299 del AT雜合2例，雙方235 del C雜合7例，235 del C雜合與299 del AT雜合5例，235 del C雜合與538 C>T雜合1例，235 del C雜合與IVS7-2 A>G雜合2例，雙方299 del AT雜合1例，299 del AT雜合與IVS7-2 A>G雜合1例，538 C>T雜合與2168 A>G雜合1例，2168 A>G雜合與IVS7-2 A>G雜合2例，雙方IVS7-2 A>G雜合3例)。

(5)夫婦的一方為單一位點(diǎn)雜合突變，另一方為單一位點(diǎn)純合突變或兩個位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-05)，共10例6種組合(235 del C雜合與235 del C純合3例，235 del C雜合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，299 del AT雜合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，2168 A>G雜合與235 del C純合1例，IVS7-2 A>G雜合與235 del C純合2例，IVS7-2 A>G雜合與IVS7-2 A>G純合2例)。

(6)夫婦雙方都是單一位點(diǎn)純合突變或兩個位點(diǎn)復(fù)合突變(類型編號3-06)，共3例3種組合(235 del C純合與176 del 16雜合235 del C雜合1例，235 del C純合與235 del C雜合299 del AT雜合1例，雙方235 del C雜合299 del AT雜合1例)。

(7)男方線粒體突變和女方9個位點(diǎn)均為野生型(類型編號3-07)，共10例2種組合(1494 C>T均質(zhì)1例，1555 A>G均質(zhì)9例)。

(8)男方線粒體突變和女方單一位點(diǎn)雜合突變(類型編號3-08)，共1例(1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C雜合1例)。

(9)男方線粒體突變和雙方其他突變(類型編號3-09)，共5例4種組合(1555 A>G均質(zhì)235 del C雜合與女方235 del C雜合1例，1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C純合2例，1555 A>G均質(zhì)與女方235 del C雜合299 del AT雜合1例，1555 A>G均質(zhì)與女方IVS7-2 A>G雜合1例)。

(10)女方線粒體突變和雙方其他突變(類型編號3-10)，共16例5種組合(1555 A>G均質(zhì)11例，1555 A>G均質(zhì)IVS7-2 A>G雜合與男方235 del C純合1例，1555 A>G均質(zhì)與男方235 del C雜合2例，1555 A>G均質(zhì)與男方235 del C純合1例，1555 A>G均質(zhì)與男方IVS7-2 A>G雜合1例)。

(11)雙方線粒體突變(類型編號3-11)，共2例2種組合(1555 A>G均質(zhì)1例，男方1555 A>G均質(zhì)與女方1555 A>G異質(zhì)1例)。

五、高危人群夫婦的生育(或再生育)風(fēng)險評估

在以上36個家庭和108對夫婦中4個基因9個位點(diǎn)檢測有37個耳聾基因突變類型(74種組合)，生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險分析結(jié)果，子女不攜帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-04、2-03和3-07，共有13例；部分子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-14、1-20、3-01和3-08，共有20例；全部(或>1/2)子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因的為類型編號1-02和3-02，共有10例；全部(或>1/2)子女?dāng)y帶相關(guān)突變基因并可能生育聾兒的為類型編號1-01、1-03、1-05、1-06、1-07、1-08、1-09、1-10、1-11、1-12、1-13、1-14、1-15、1-16、1-17、1-18、1-19、1-21、2-01、2-02、2-04、3-03、3-04、3-05、3-06、3-09、3-10和3-11，共有101例。見表4。

表4 生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險分析

Note: “carrier” refers to child carrying deafness gene mutations, which are inherit from parents; “√” represents fertility risk; “×” represents no fertility risk.

討 論

對有生育或再生育意愿的聾人家庭及高危夫婦進(jìn)行孕前耳聾基因篩查可以了解該人群耳聾基因攜帶狀況，并進(jìn)行生育風(fēng)險評估[5]、咨詢指導(dǎo)和發(fā)現(xiàn)攜帶耳聾基因后防治[6]。

本研究中高危人群篩查檢測結(jié)果，聾人和非聾人耳聾基因突變攜帶率分別為48.0%和48.8%，與相關(guān)文獻(xiàn)報道的耳聾患者檢測耳聾基因突變攜帶率，如張旭等報道的43.6%、胡煜等報道的44.1%、彭新等報道的52.2%和王荷溪等報道的55.2%相接近[7-10]。聾人和非聾人的不同耳聾基因攜帶情況存在差異，聾人攜帶SLC26A4和mtDNA 12S rRNA耳聾基因較多，而非聾人攜帶GJB2耳聾基因較多，差異的原因有待增大人群數(shù)量來確定和分析。研究發(fā)現(xiàn)GJB2缺陷可能通過引起耳蝸發(fā)育異常，毛細(xì)胞退化以及內(nèi)耳蝸電位降低導(dǎo)致先天性耳聾[11-13]。進(jìn)一步分子機(jī)理研究認(rèn)為小鼠中GJB2敲除導(dǎo)致的耳蝸內(nèi)miRNA(如miR-96)的表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致其耳蝸發(fā)育異常[14]，而耳蝸中非感覺性細(xì)胞GJB2表達(dá)降低會導(dǎo)致影響內(nèi)耳毛細(xì)胞的成熟[15]。GJB3耳聾基因主要表達(dá)于耳蝸螺旋韌帶細(xì)胞的III型纖維細(xì)胞，其導(dǎo)致先天性耳聾的機(jī)制不明[16]。SLC26A4基因編碼的Pendrin蛋白表達(dá)于內(nèi)淋巴管和內(nèi)淋巴囊上皮細(xì)胞及橢圓囊和球囊邊緣的神經(jīng)細(xì)胞中，介導(dǎo)細(xì)胞碳酸氫鈉離子、氯離子和碘離子等的交換。Pendrin蛋白表達(dá)異?？赡芡ㄟ^影響細(xì)胞內(nèi)外陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而影響聲音傳遞導(dǎo)致遲發(fā)型耳聾[17-18]。關(guān)于mtDNA 12S rRNA突變引發(fā)藥物導(dǎo)致耳聾的病理機(jī)制有兩種假說，一種認(rèn)為12S rRNA突變加劇了線粒體內(nèi)核糖體mRNA的誤讀從而導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)[19-20]，另一種認(rèn)為12S rRNA的1555A>G突變引起的12S rRNA的超甲基化與耳聾癥狀具有相關(guān)性[21]。

占遺傳性耳聾70%的非綜合征型耳聾主要為孟德爾單基因遺傳病，按遺傳方式分為常染色體顯性遺傳(DFNA)、常染色體隱性遺傳(DFNB)、X-連鎖(DFNX)、Y-連鎖(DFNY)和線粒體遺傳，其中DFNX較為少見，DFNY罕見報道[1]，本研究主要探討占約80%DFNB和線粒體遺傳。對于DFNB，聾兒的父母多為擁有正常聽力的突變耳聾基因攜帶者，再次生育其后代25%為耳聾患者。聾兒的每個同胞有25%的幾率為耳聾患者，50%的幾率是正常聽力的攜帶者，25%為正常人。聾人與正常人婚配的后代100%為攜帶者，聾人與正常聽力的攜帶者的后代50%為耳聾患者，聾人與攜帶相同致聾基因的耳聾患者結(jié)合的后代100%為耳聾患者，男女患病機(jī)會均等。對于線粒體基因突變導(dǎo)致的耳聾，其再發(fā)風(fēng)險率的估計比較復(fù)雜，帶有突變線粒體DNA(mtDNA)的個體是否發(fā)病受許多因素影響，與突變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度、突變mtDNA所占比例、核基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)以及不同組織細(xì)胞的能量閾值均有一定關(guān)系。對于均質(zhì)性的1555 A>G、1494 C>T突變，符合經(jīng)典的母系遺傳方式，mtDNA的突變可通過母親傳給后代，后代男女均可發(fā)病，但只有女性可將突變的mtDNA繼續(xù)傳給下一代，而男性則不再下傳[1]。

本研究的144例(個或?qū)?聾人家庭和高危夫婦的檢測中有37個耳聾基因突變類型(74種組合)，對于這些聾人家庭和高危夫婦可以參考表4給予生育(或再生育)咨詢指導(dǎo)風(fēng)險分析。其中有101例存在生育聾兒的可能，建議在生育(或再生育)時進(jìn)行產(chǎn)前診斷，必要時運(yùn)用胚胎移植前遺傳學(xué)診斷技術(shù)(PGD)或采用臨床其他診療方法，可以減少或避免聾兒的出生。