岳彩鵬， 王 寧， 李園園， 黃進(jìn)勇， 朱世新， 黃盈盈， 史亞周， 胡大洋

(1.鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 河南 鄭州 450001； 2.河南龍宇煤化工有限公司 河南 永城 476600)

0 引言

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本試驗采用煙草K326作為供試品種.

1.2 實驗方案

各組處理結(jié)束之后，正常條件培養(yǎng)，每天觀察記錄煙苗生長狀況，每隔5 d觀察記錄煙草花芽分化情況，適時選取莖尖固定保存，統(tǒng)計煙草現(xiàn)蕾葉片數(shù).

1.3 生理指標(biāo)測定及方法

1.3.2過氧化氫(H2O2)含量測定 采用Sergiev[15]等的方法，樣品加入三氯乙酸(TCA)溶液研磨，在上清液中加入碘化鉀，反應(yīng)結(jié)束后，390 nm測定吸光值.

1.4 開花基因表達(dá)量的測定

使用鄭州貝貝生物科技有限公司的總RNA提取試劑盒提取RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白分析儀測定OD值，檢測RNA完整性和濃度；使用北京愛普拜生物技術(shù)有限公司的Hiscript cDNA 合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：總RNA最大5 μg，Primer(Oligo dT) 0.5 μL，加Nuclease-free water至11.7 μL，70 ℃孵育5 min，立即置于冰水中至少5 min，之后加入5×RT buffer 4 μL，MgCl22 μL，dNTPs 1 μL，RNase抑制劑0.3 μL，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為25 ℃，5 min；42 ℃，1 h；75 ℃，15 min.

煙草目的基因LFY(GenBank: JQ686928.1)以及內(nèi)參基因β-actin(GenBank: NO.U60495)的引物通過軟件DNA man設(shè)計，F(xiàn)LC引物參照文獻(xiàn)[16].LFY基因引物F：TAAGCCAAAAATGCGACACT，R：GTTCAGAATGGCAAAGCTGG；FLC基因引物F：CTCAAGAAAATAGCAGCCTTCC，R：TCTCCTTATTGCTCCTCACACA；β-actin基因引物F：ATGCCTATGTGGGTGACGAAG，R：TCTGTTGGCCTTAGGGTTGAG，均由上海生工合成.

實時熒光定量PCR試劑盒為FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)，反應(yīng)儀器為Roche LightCycler?480 II全自動熒光定量PCR系統(tǒng).20 μL反應(yīng)體系為：HiTaq SYBR Green Mastermix(2x) 10 μL，F(xiàn)orward Primer(10 mM) 0.4 μL，Reverse Primer(10 mM) 0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O(滅菌蒸餾水)8.2 μL.

反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s；60 ℃退火20 s；72 ℃延伸20 s，40個循環(huán).

1.5 觀察花芽解剖結(jié)構(gòu)并記錄現(xiàn)蕾葉片數(shù)

花芽解剖結(jié)構(gòu)的觀察：處理結(jié)束后每隔5 d取莖尖，標(biāo)記后FAA固定液保存，用體式顯微鏡Nikon SMZ800觀察并拍照.FAA固定液配比：38%甲醛5.0 mL，冰乙酸5.0 mL，75%乙醇90.0 mL[17].

根據(jù)煙株上掛牌標(biāo)記的葉位，及時觀察并記錄煙草現(xiàn)蕾時的葉片數(shù).

1.6 數(shù)據(jù)處理

Real-time PCR實驗中每個樣品均做3個技術(shù)重復(fù)，Real-time PCR實驗中得各樣品Ct值及其平均值，擴(kuò)增曲線、溶解曲線等均由計算機(jī)自帶軟件導(dǎo)出，根據(jù)公式ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，用2-ΔΔCt法計算各基因表達(dá)量.以對照組5 d時基因擴(kuò)增結(jié)果作為對照，將其表達(dá)水平設(shè)置為1.實驗所得的數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析和方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源甲基紫精處理對煙草活性氧含量的影響

圖1 外源甲基紫精處理下煙草葉片和H2O2含量的快速響應(yīng)Fig.1 Rapid response of and H2O2 content in tobacco under exogenous methylviologen condition

表1 長期外源甲基紫精處理下煙草葉片含量的變化Tab.1 The change of contentin tobacco under long-time exogenous methylviologen treatment μmol/g

注：*表示0.05水平顯著差異；**表示0.01水平極顯著差異.

長期噴施甲基紫精的煙草體內(nèi)H2O2含量均高于對照(表2)，而噴施結(jié)束一定時間后H2O2含量會有所回落.T1組在處理第5天顯著高于對照組，處理結(jié)束后，體內(nèi)H2O2也隨即降低，與對照差異不顯著.T2組在處理第10天、15天時分別比對照增加了18.6%、33.4%，第20天開始下降.長期噴施甲基紫精對煙草體內(nèi)H2O2代謝影響較大，同時也使保護(hù)體系受到抑制，清除能力下降，噴施時間越長，體內(nèi)H2O2積累越多.噴施15 d、20 d、25 d的T3、T4和T5組隨著處理時間延長，H2O2含量一直顯著高于對照.煙草體內(nèi)長期較高水平的H2O2使煙草受到活性氧傷害，嚴(yán)重影響了煙草的生長發(fā)育.

表2 長期甲基紫精處理下煙草葉片H2O2 含量的變化Tab.2 The change of H2O2 content in tobacco under long-time methylviologen condition μmol/g

注：*表示0.05水平顯著差異；**表示0.01水平極顯著差異.

2.2 外源甲基紫精對基因FLC、LFY表達(dá)量的影響

外源甲基紫精對煙草開花抑制基因FLC表達(dá)量的影響如表3所示，外源甲基紫精作用下FLC表達(dá)量整體呈下降趨勢.噴施5 d的T1組在處理15 d時迅速下降接近最低點，并且從第15天開始FLC表達(dá)量顯著低于對照；T2組在前期FLC的表達(dá)量并沒有顯著差異，第25天顯著低于對照；T3、T4、T5的變化趨勢比較類似，整體呈下降趨勢，但差異與對照不顯著.總之，外源甲基紫精處理煙草5 d和10 d都表現(xiàn)出對開花抑制基因FLC表達(dá)的抑制，但噴施時間過長，對FLC表達(dá)抑制作用不明顯.

表3 外源甲基紫精對基因FLC表達(dá)量的影響Tab.3 The effects of expression of FLC in tobacco under exogenous methylviologen

注：*表示0.05水平顯著差異；**表示0.01水平極顯著差異.

外源甲基紫精對LFY表達(dá)量的影響如表4所示，整體上是外源甲基紫精作用下LFY表達(dá)量呈升高的趨勢，表明外源甲基紫精可以促進(jìn)煙草成花基因的表達(dá)，但是促進(jìn)的程度并不一致.噴施5 d的T1組在處理10 d時LFY表達(dá)量有明顯的增強(qiáng)，20 d、25 d后增幅分別為63.1%、87.1%，與對照差異顯著；噴施10 d的T2組LFY表達(dá)量也一直呈上升的趨勢，前期與對照差異不明顯，在25 d時差異極顯著.T3、T4、T5組LFY表達(dá)量與對照差異不顯著.

表4 外源甲基紫精對基因LFY表達(dá)量的影響Tab.4 The effects of expression of LFY in tobacco under exogenous methylviologen

注：*表示0.05水平顯著差異；**表示0.01水平極顯著差異.

圖2 外源甲基紫精條件下煙草花芽分化情況Fig.2 The flower bud differentiation of tobacco under exogenous methyl viologen

2.3 外源甲基紫精對煙草花芽分化的影響

圖2是噴施外源甲基紫精22 d后各組的花芽分化圖，其中CK處于營養(yǎng)生長期，T1處于雌蕊原基分化期，處于花芽分化的末期.T2處于雄蕊原基和雌蕊原基分化期，花瓣原基、雄蕊原基和雌蕊原基都已經(jīng)分化，但是雄蕊原基內(nèi)側(cè)還沒有形成凹陷，分化進(jìn)程略晚于T1.T3處于花瓣、雄蕊原基分化期，圖2 T3中可見5個雄蕊原基微微凸起，在其外側(cè)與其互生的是花瓣原基，最內(nèi)側(cè)的圓形凸起是雌蕊原基，尚未分化.T4、T5均處于花萼原基分化期，以上結(jié)果表明，外源甲基紫精處理使T1、T2、T3、T4、T5各組花芽分化都有不同程度的提前，噴施時間不同，促進(jìn)發(fā)育的程度也有差異，噴施5 d和10 d 的T1、T2處理促進(jìn)效果最為明顯，噴施15 d的T3處理次之.這與外源甲基紫精噴施5 d和10 d的T1、T2處理組的開花抑制基因FLC表達(dá)量顯著下調(diào)，同時花分生組織基因LFY表達(dá)量顯著上調(diào)的結(jié)果一致.

2.4 外源甲基紫精對煙草現(xiàn)蕾葉片數(shù)的影響

由圖3可知，外源甲基紫精處理下， T1、T2、T3、T4、T5處理組煙草的現(xiàn)蕾葉片數(shù)與CK相比分別減少了3.75、3.75、4、2.25、1.5片真葉，現(xiàn)蕾均有提前.T1與T3與對照差異顯著，T2與對照差異極顯著.這與花芽解剖觀察結(jié)果基本一致，噴施甲基紫精5 d、10 d、15 d使煙草體內(nèi)活性氧含量在一定時間內(nèi)升高，抑制了開花抑制基因FLC表達(dá)，促進(jìn)了花分生組織基因LFY的表達(dá)，從而促進(jìn)了煙草花發(fā)育，但噴施時間過長，超過15 d后，體內(nèi)活性氧含量一直維持高濃度，細(xì)胞氧化損傷嚴(yán)重，對開花促進(jìn)基因LFY表達(dá)不利.

圖3 外源甲基紫精條件下煙草現(xiàn)蕾葉片數(shù)Fig.3 Leaf number of tobacco when buds occur under exogenous methyl viologen

3 討論

開花是植物從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)換為生殖生長的生理發(fā)育過程，受光周期、溫度、激素、年齡等多個因素誘導(dǎo)，在植物生長和物種進(jìn)化中處于核心地位[18].在擬南芥中已經(jīng)鑒定出5個關(guān)鍵開花整合子，分別是FLC、FT、SOC1、LFY和SVP，主要位于細(xì)胞核內(nèi)，編碼的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子在生殖生長過程中扮演著開花時間促進(jìn)基因和花分生組織決定基因雙重角色[19].FLC是開花抑制基因，在植物營養(yǎng)生長階段表達(dá)量較高，抑制下游花發(fā)育正調(diào)控因子的表達(dá).LFY是開花促進(jìn)基因，在成花轉(zhuǎn)變早期高表達(dá)，促進(jìn)下游花器官發(fā)育基因的表達(dá)，促進(jìn)成花.

活性氧被證實參與多種生理生化反應(yīng)，影響植株的生長發(fā)育.研究發(fā)現(xiàn)20種被子植物的花都有H2O2積累，特別是在柱頭[24].文獻(xiàn)[25]對兩種景觀樹種研究結(jié)果表明，ROS參與了多種花器官早期的發(fā)育階段，在花發(fā)育早期，ROS水平在所有花組織中水平較高，然后在發(fā)育后期降至低水平，ROS水平在雄蕊中最高.文獻(xiàn)[26]進(jìn)行了荔枝盆栽實驗，分別進(jìn)行低溫、中溫和高溫處理，中溫組的樹木進(jìn)行ROS處理后促進(jìn)了開花.本實驗研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫和外源過氧化氫處理都引起煙草體內(nèi)活性氧代謝失衡，煙草現(xiàn)蕾時葉片數(shù)減少，煙草花芽分化提前完成[4-5].而有關(guān)ROS作為信號分子對植物成花轉(zhuǎn)變及花發(fā)育的調(diào)控的分子機(jī)制還沒有深入研究報道.