郝嬋娟 陳臘梅 郭 俊 郭若蘭 唐浩勛 李 巍

Noonan綜合征(Noonan syndrome，NS)是一種常染色體顯性遺傳病，主要臨床表現(xiàn)為先天性心臟病、身材矮小、特殊面容、發(fā)育遲緩、凝血功能障礙、骨骼畸形等，累及多個系統(tǒng)器官[1-3]。在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率約為1/2 500～1/1 000[3-4]。家族性復(fù)發(fā)符合常染色體顯性遺傳模式，但散發(fā)病例更為常見，約占60%[5]。目前認為，NS發(fā)病與絲裂原活化蛋白激酶信號傳導通路(RAS-mitogen-activated protein kinase，RAS-MAPK)的信號異常相關(guān)。隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展和運用，目前已明確多個基因與NS及類NS樣疾病相關(guān)，包括PTPN11、SOS1、RAF1、BRAF、KRAS、NRAS、SHOC2、CBL、MAP2K1、SOS2、RIT1、RASA2和A2ML1[6-8]等。本研究對1例疑似NS患兒及其父母進行全外顯子測序，發(fā)現(xiàn)該患兒存在1個BRAF基因的新生雜合突變。通過回顧患兒的臨床表型、實驗室檢查，分析突變基因型與臨床表型相關(guān)性，將為NS患兒臨床診斷、治療和遺傳咨詢提供更好的依據(jù)。

資料與方法

1.病例選擇 患兒，身高75cm，體質(zhì)量10kg，生長發(fā)育落后(1歲，可獨坐；3歲，可說單個詞語；4歲，可扶走，有眼神交流，對答反應(yīng)略緩慢，無智力倒退史，否認驚厥史)，軀干與四肢皮膚無斑點角化過度，頭發(fā)偏少，略卷曲，但發(fā)質(zhì)正常，無明顯脫落。特殊面容：前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、無外眼角下垂及眼球震顫、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋、小頜畸形、頸短(圖1)。胸廓未見畸形。心前區(qū)無異常隆起，心音有力，律齊，胸骨左緣第二肋間聞及3/6級收縮期雜音。掌跖皮膚大致正常。肌張力基本正常，肌力Ⅴ—級?；純簽榈诙サ诙a(chǎn)，足月順產(chǎn)，出生時體質(zhì)量3.4kg。母孕期常規(guī)檢查，超聲心動圖提示：胎兒心胸比增大，心臟增大，室壁增厚，二尖瓣、三尖瓣、靜脈導管頻譜異常，動脈導管舒張期血流增快，卵圓孔偏大，偶發(fā)心動過緩。出生后3個月于我院行超聲心動圖檢查，確診為輕度肺動脈瓣狹窄、卵圓孔未閉。9月齡時查發(fā)育商低下。1歲6個月時于我院行超聲心動圖，示中度肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉(圖2)。2歲時于某醫(yī)院完成肺動脈瓣狹窄球囊擴張術(shù)。2歲時，腸系淋巴結(jié)彩色多普勒超聲檢查腹腔內(nèi)未見明顯腫大淋巴結(jié)。3歲前患兒反復(fù)呼吸道感染。

2. 實驗室檢查 9個月齡時血尿代謝病篩查未見異常，2歲時于肺動脈瓣狹窄球囊擴張術(shù)前進行血常規(guī)、肝腎功能、出凝血時間、免疫球蛋白檢查，結(jié)果均正常。氨基酸、肉堿血代謝篩查未發(fā)現(xiàn)特異性脂肪酸代謝異常。血生化檢查示堿性磷酸酶(ALP)偏高(156U/L，正常范圍35～100U/L)，肌酐(CREA)偏低(18.3μmol/L，正常范圍45～84 μmol/L)。全血細胞分析：血小板(PLT)數(shù)量正常，血小板分布寬度(PDW)偏低(7.8%，正常范圍9.9%～16.1%)，大血小板比率(P-LCR)偏低(7.8%，正常范圍13%～43%)。

2017年8月患兒家屬來北京兒童醫(yī)院遺傳咨詢門診進行遺傳咨詢。父母非近親結(jié)婚，家族中無類似患兒。本研究得到北京市兒童醫(yī)院倫理委員會批準，并經(jīng)患兒及其家屬知情同意，簽訂知情同意書。

圖1 患兒主要臨床特征 A～B：正面圖，C～D：側(cè)面圖

圖2 患兒超聲心動圖 圖示中度肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄、卵圓孔未閉。房間隔卵圓窩處回聲中斷約2.6mm。肺動脈瓣為三葉瓣，瓣膜回聲稍粗厚，活動尚可， 瓣環(huán)徑約11.6mm，瓣口徑約8.3mm

3．基因組DNA的提?。喝』純杭捌涓改竿庵莒o脈血2mL(EDTA抗凝)，用QIAamp全血DNA提取試劑盒(德國Qiagen公司)提取基因組DNA。

4．全外顯子測序：將基因組DNA打斷成隨機片段，經(jīng)純化后使用Agilent SureSelect Human All Exome V6試劑盒(加拿大Agilent Technologies公司)進行全基因組外顯子捕獲，捕獲后的片段經(jīng)過富集度質(zhì)控后進行測序文庫制備，利用Illumina Hiseq X Ten測序儀(美國Illumina公司)進行雙端高通量測序，讀長為150bp，測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過基本數(shù)據(jù)分析(Base calling、過濾接頭序列、去污染)，運用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件[9]比對到GRCh37/hg19參考基因組上，識別樣本的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和插入缺失突變(InDels)并對其所在基因進行注釋，同時進行測序深度、覆蓋度及均一性等有效數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

5．生物信息學分析：利用dbSNP數(shù)據(jù)庫、千人基因組、ExAC數(shù)據(jù)庫分析變異頻率，濾掉次等位基因頻率>0.005的普遍變異。利用五種預(yù)測軟件SIFT(http://sift.jcvi.org/www/SIFT_enst_submit.html)、Polyphen-2(http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)、Mutation Taster(http://www.mutationtaster.org)、Mutation Assessor(http://mutationassessor.org/)和CADD(http://cadd.gs.washington.edu/)對變異位點進行有害性分析，以鑒定變異對蛋白質(zhì)功能的潛在影響。同時篩查變異位點是否被三個疾病數(shù)據(jù)庫(ClinVar、OMIM、HGMD)收錄為有害變異。此外，利用UCSC(http://genome.ucsc.edu)進行BRAF新發(fā)突變位點同源序列保守性分析，利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/protein/P15056)進行BRAF新發(fā)突變位點結(jié)構(gòu)域分析。利用美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG)分級標準對變異進行分級[10]。

6．Sanger測序驗證：根據(jù)需要測序的DNA片段合成引物，對患兒及其父母DNA用PCR的方法進行擴增，用ABI 3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以Sanger測序法進行測序，測序結(jié)果與全外顯子測序后的結(jié)果進行比對。

結(jié) 果

圖3 患兒及其父母基因檢測結(jié)果 在患兒BRAF基因中找到新生雜合錯義突變c.770A>G(p.Q257R)(紅色箭頭)，其父母均無此變異(綠 色箭頭)

1. 基因檢測結(jié)果：通過生物信息學分析，在患兒BRAF基因中找到一個雜合錯義突變c.770A>G(p.Q257R)，導致該蛋白第257位的谷氨酰胺改變?yōu)榫彼?，其父母此位點為正?；蛐?，該變異為患兒“新發(fā)突變”。設(shè)計引物擴增后進行Sanger 測序，測序結(jié)果與全外顯子測序結(jié)果相同(圖3)。該患兒有一位7歲的哥哥, 生長發(fā)育無異常，未做基因檢測。BRAF突變可導致心面皮膚綜合征(cardio-facio-cutaneous，CFCS)和NS。c.770A>G(p.Q257R)在三個SNP數(shù)據(jù)庫(dbSNP，千人基因組和ExAC)中未發(fā)現(xiàn)變異頻率，dbSNP報告的SNP號為rs180177035(表1)。HGMD、ClinVar和OMIM三個疾病數(shù)據(jù)庫收錄該變異為致病變異。五種預(yù)測軟件SIFT、Mutation Taster、Polyphen-2、Mutation Assessor、CADD預(yù)測該變異對蛋白質(zhì)功能是有害或可能有害的(表2)。BRAF新發(fā)突變位點位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域(圖4)，在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性(圖5)。根據(jù)ACMG分級標準，我們將BRAF c.770A>G分級為致病變異。

2. 患兒的臨床特征符合NS的診斷標準[11]，結(jié)合基因檢測結(jié)果，診斷為NS。

圖4 BRAF c.770A>G(p.Q257R)位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域

圖5 BRAF c.770A>G(p.Q257R)在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性

基因轉(zhuǎn)錄本cDNA蛋白雜合性ExAC千人基因組dbSNPBRAFNM_004333c.770A>Gp.Q257R雜合子--rs180177035

表2 患兒BRAF c.770A>G致病性預(yù)測

討 論

通過對患兒及父母進行全外顯子測序，我們發(fā)現(xiàn)患兒在BRAF基因存在一個新發(fā)錯義突變c.770A>G(p.Q257R)。BRAF含18個外顯子，位于染色體7q34，編碼參與MAPK/ERK信號傳導途徑的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是RAS的效應(yīng)物和MAPK組件的上游組分，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、分化、增殖、衰老和凋亡，在癌癥和發(fā)育綜合征中發(fā)揮重要作用[12-15]。

BRAF是CFCS的主要致病基因(約占50%～75%)，而在NS病例中極少見(<2%)[16]。與CFCS相關(guān)的BRAF突變大部分發(fā)生在外顯子6和外顯子12上。錯義突變c.770A>G(p.Q257R)是發(fā)生在外顯子6的最常見的突變(發(fā)生率為29%)[12]。BRAF c.770A>G位于甘油二酯和佛波酯結(jié)合結(jié)構(gòu)域，多種預(yù)測軟件預(yù)測該變異對蛋白質(zhì)功能是有害或可能有害，在不同物種間具有同源序列，且具有高度保守性。Tetsuya 等的研究表明c.770A>G(p.Q257R)突變顯著激活ELK依賴性轉(zhuǎn)錄，有助于BRAF的激活，刺激RAS-ERK途徑[14]，最終ERK信號分子進入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄并對刺激信號作出反應(yīng)。根據(jù)ACMG分級標準，BRAF c.770A>G分級為致病變異。

大部分報道表明BRAF c.770A>G突變引起CFCS[12, 14, 17]，但是也有這個突變位點引起NS的報道[18]。CFCS與NS均為RAS-MAPK信號通路異常導致的疾病，故二者具有相似的臨床特征。

NS主要臨床特征包括身材矮小、特殊面容、先天性心臟病、發(fā)育遲緩、出血傾向、胸骨畸形、淋巴系統(tǒng)發(fā)育不良等，可累及多個系統(tǒng)器官。特殊面容包括前額寬大突出、眼距寬、眼瞼下垂、鼻梁扁平、鼻尖飽滿、耳位偏低伴耳輪后旋和增厚、頭發(fā)卷曲、后發(fā)際線低等，心臟病變最常見的是肺動脈狹窄(通常伴有異常增生的瓣膜，50%～60%)、肥厚型心肌病(20%)和繼發(fā)性房間隔缺損(6%～10%)[1- 2, 4, 19- 20]。

CFCS絕大多數(shù)病例由BRAF、MEK1、MEK2基因突變引起，常見的臨床表現(xiàn)包括特征性顱面畸形、先天性心臟病、皮膚異常、生長發(fā)育遲緩、胃腸功能紊亂、神經(jīng)認知延遲和癲癇發(fā)作[21]。

CFCS與NS的區(qū)別在于存在外胚層發(fā)育異常和更嚴重的智力障礙[22]。與NS患者相比，CFCS患者的面部更寬、呈現(xiàn)大頭畸形、毛發(fā)生長緩慢，睫毛和眉毛稀疏或缺失、毛囊角化和掌跖角化過度、肌張力低下及更嚴重的發(fā)育遲緩和嬰兒期喂養(yǎng)問題[23-24]。為明確診斷，我們進一步比較了本例患兒的臨床表型與CFCS和NS的異同。本例患兒臨床表現(xiàn)為生長發(fā)育落后、特殊面容，超聲檢查示肺動脈瓣及瓣下流出道狹窄，卵圓孔未閉。此患兒雖有生長發(fā)育落后，但程度較輕，與醫(yī)生有眼神交流，對答正確，僅略顯緩慢。神經(jīng)系統(tǒng)檢查，肌張力基本正常，肌力稍低。本例患兒的臨床表型符合NS，BRAF c.770A>G為疾病的致病變異。中國人群中的相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)已報道4例基因診斷明確的NS患兒存在BRAF基因的新發(fā)雜合錯義突變[18]，其中有1例的突變位點與本例相同，臨床表型與本例患者基本相同，但出現(xiàn)喂養(yǎng)困難及胸部畸形，先天性心臟異常則表現(xiàn)為房間隔缺損。

NS的遺傳異質(zhì)性強，同一基因突變可有不同的臨床表現(xiàn)，甚至同一基因同一位點突變，臨床亦可表現(xiàn)明顯差異，所以僅通過臨床表型很難進行臨床診斷，而應(yīng)結(jié)合分子遺傳學分析，從基因水平幫助臨床進行精確診斷。傳統(tǒng)的Sanger測序法測序通量較低，難以滿足NS基因診斷需求，需要高通量的方法來進行致病基因的檢測。近年來，隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展和生物信息學分析手段的豐富，全外顯子測序，作為一種快速而經(jīng)濟的技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于遺傳性疾病的診斷[25-28]，其不僅使患兒在短時間內(nèi)得到確診，還為理解疾病發(fā)病機制提供線索，從而引導臨床醫(yī)生尋求更可靠的遺傳咨詢以及更有針對性的臨床干預(yù)和治療。

NS缺乏特異性治療方案，目前仍以對癥治療為主，建議多學科聯(lián)合隨訪。典型的面部特征會隨年齡的增長而逐漸改變。先天性心臟異常如肺動脈瓣狹窄，可根據(jù)狹窄程度，選擇定期隨訪、介入治療或外科手術(shù)。本例患兒則采用肺動脈瓣狹窄球囊擴張術(shù)進行治療。在2007年，美國食品藥品監(jiān)督局推薦伴有身材矮小的NS患兒可給予重組人生長激素(rhGH)治療。目前，國內(nèi)也推薦rhGH用于治療伴有身材矮小的NS患兒[29]。與此同時，預(yù)防干預(yù)亦不容忽視，產(chǎn)前基因診斷有助于預(yù)防患兒出生，也是目前主要的干預(yù)措施?；蛟\斷不僅可以評估患兒的預(yù)后，還可為相關(guān)家庭再次生育提供產(chǎn)前咨詢和產(chǎn)前診斷的依據(jù)，以期真正達到預(yù)防和降低NS發(fā)生率的目的。