胡蒙亮 高豐衣 任航江 韓亭亭 滿 永 李國(guó)平 黎 健

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和現(xiàn)代生活方式與飲食習(xí)慣的改變，非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)已經(jīng)成為影響發(fā)達(dá)國(guó)家三分之一成年人和越來越多兒童的重要代謝性疾病[1]，在中國(guó)人群中NAFLD也已經(jīng)成為重要的公共健康問題之一[2]。最近的研究表明，I型11β-羥基類固醇脫氫酶(11β-hydroxysteroid dehydrogenase type,11β-HSD1)與肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，在 NAFLD 的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[3]。在成年哺乳動(dòng)物中，11β-HSD1廣泛分布于肝臟、脂肪、性腺和腦中，通過活化局部組織中的糖皮質(zhì)激素水平在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用[4]，但對(duì)其在脂代謝作用方面的調(diào)控機(jī)制知之甚少。本研究通過肝臟過表達(dá)11β-HSD1，探究其對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝的影響及調(diào)控機(jī)制。

表1 檢測(cè)基因的引物

注：SREBP1c：固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c；ACC1：乙酰輔酶A羧化酶；FAS：脂肪酸合成酶；SCD1：硬脂酰輔酶A去飽和酶

材料與方法

1.材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系為C57BL/6遺傳背景雄性小鼠，12周齡，普通飲食，動(dòng)物飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；蛋白激酶B(AKT)抗體、糖原合酶激酶-3β(GSK)抗體、磷酸化蛋白激酶B(Phospho-AKT, Ser473)抗體、磷酸化糖原合酶激酶-3β(Phospho-GSK-3β, Ser9)抗體、脂肪酸合成酶(FAS)抗體、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD1)、抗體乙酰輔酶A羧化酶(ACC1)抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；11β-HSD1抗體購(gòu)自美國(guó)R&D公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG相關(guān)抗原抗體、HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG相關(guān)抗原抗體、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP1)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.方法 (1) 腺病毒的擴(kuò)增與純化 在293A細(xì)胞中擴(kuò)增腺病毒Ad-GFP和Ad-11β-HSD1，用試劑盒(Vivapure Adeno PACK 100 kit, Vivascience)純化，測(cè)定OD值，凍存于-80℃。小鼠尾靜脈注射腺病毒Ad- GFP和Ad-11β-HSD1，劑量為每只小鼠5.0×1010病毒顆粒。

(2)動(dòng)物模型的建立 取20只C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組10只，其中對(duì)照組尾靜脈注射腺病毒Ad-GFP，另一實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1，注射后每天觀察小鼠的生活狀態(tài)。小鼠注射腺病毒后，耐受性良好，飲食正常。

(3)肝臟組織脂質(zhì)含量的測(cè)定 腺病毒感染小鼠兩周后，禁食4h后稱量小鼠體質(zhì)量，并進(jìn)行眼眶后靜脈叢采血，離心收集血漿。采血后進(jìn)行麻醉處死，收集肝臟組織后稱重，并凍于液氮備用。切取肝臟組織100mg左右，根據(jù)參考文獻(xiàn)[5]進(jìn)行肝臟脂質(zhì)內(nèi)容物提取，酶法測(cè)定TC和TG含量。

(4)肝臟組織冰凍切片油紅O染色 取小塊肝臟組織，OCT包埋，切為8～10μm厚冰凍切片并貼片于潔凈載玻片。10%甲醛固定15min，PBS洗1min，60%異丙醇浸洗數(shù)秒，取出切片并完全干燥后油紅O工作液室溫染色30min，60%異丙醇分化數(shù)秒，PBS洗3次，蘇木素復(fù)染核8s，流水沖洗返藍(lán)，甘油封片后鏡檢，照相。

(5)脂代謝相關(guān)蛋白和胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白的免疫印跡法分析 凍存的組織標(biāo)本采用RIPA蛋白質(zhì)提取緩沖液提取總蛋白， BCA法測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣品取20μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF膜濕轉(zhuǎn)3h，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，相應(yīng)一抗于4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10min。相應(yīng)二抗室溫孵育3h，洗膜3次，每次10min，用化學(xué)發(fā)光液顯影，并用凝膠成像儀照相，采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

圖1 肝臟過表達(dá)11β-HSD1小鼠表型A:小鼠肝臟組織11β-HSD1蛋白表達(dá)水平；B: Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖；C:小鼠體質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖；D:小鼠肝臟質(zhì)量統(tǒng)計(jì)圖；E:小鼠肝質(zhì)量/體質(zhì)量百分比統(tǒng)計(jì)圖。注：與對(duì)照組比較，n=10，*P<0.05，**P<0.01

(6)檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用Trizol提取肝臟組織總RNA，測(cè)定濃度及RNA質(zhì)量后，取5μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，將cDNA稀釋20倍后進(jìn)行目的基因的檢測(cè)，總反應(yīng)體系為20μL：2×SYBR Green PCR Mix 10μL，上下游引物各2.5μL，模板cDNA 5μL。反應(yīng)完畢后分析產(chǎn)物溶解曲線判斷反應(yīng)的特異性并通過計(jì)算2-△△ct得到目的基因的相對(duì)表達(dá)量,引物設(shè)計(jì)見表1。

圖2 肝臟組織脂質(zhì)含量的檢測(cè) A:肝臟組織中脂質(zhì)油紅O染色結(jié)果；B:肝 臟組織中三酰甘油含量測(cè)定結(jié)果。注：與對(duì)照組比較，n=10，*P<0.05

結(jié) 果

1．尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1后，肝臟過表達(dá)該基因并使肝質(zhì)量增大 本實(shí)驗(yàn)通過小鼠尾靜脈注射腺病毒Ad-11β-HSD1，構(gòu)建小鼠非酒精性脂肪肝模型來研究其調(diào)控機(jī)制。腺病毒感染2周后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，小鼠肝臟成功過表達(dá)11β-HSD1[(1.000±0.053)vs.(1.869±0.125)，P<0.01](圖1A～B)，但兩組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，體質(zhì)量分別為(29.56±1.58)g，(29.69±1.20)g(圖1C)。過表達(dá)11β-HSD1后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝質(zhì)量為(1.44±0.20)g，顯著高于對(duì)照組的(1.26±0.16)g，(P<0.05，圖1D)。并且實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝質(zhì)量/體質(zhì)量百分比也顯著高于對(duì)照組[(4.3±0.4)vs. (4.9±0.6)，P<0.05]，圖1E。

2.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，引起肝臟脂質(zhì)蓄積 酶法測(cè)定血漿脂質(zhì)含量，結(jié)果顯示兩組小鼠血漿膽固醇和三酰甘油含量并無差異(數(shù)據(jù)未顯示)。肝臟組織冰凍切片油紅O染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，肝臟脂質(zhì)蓄積相對(duì)于對(duì)照組明顯增多，脂滴變大且分布廣泛(圖2A)。酶法測(cè)定肝臟組織脂質(zhì)含量，結(jié)果顯示肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，肝臟脂質(zhì)含量相比對(duì)照組增加35.0%[(59.61±3.2)vs. (80.47±5.1)，P<0.05]，圖2B。這一結(jié)果與油紅O染色結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，可使肝臟脂質(zhì)蓄積。

圖3 肝臟過表達(dá)11β-HSD1后增加脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白 A. Western blot檢測(cè)脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白水平； B. Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。注： n=10, *P<0.05

3.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白表達(dá)顯著增加 提取肝臟組織的總蛋白后，我們首先檢測(cè)了長(zhǎng)鏈脂肪酸合成途徑中主要的調(diào)控蛋白SREBP1，結(jié)果如圖3A～B顯示，相對(duì)于對(duì)照組，過表達(dá)11β-HSD1后，SREBP1無論是前體還是成熟肽均顯著增加，其下游調(diào)控蛋白FAS、SCD1也明顯上調(diào)，脂肪酸合成通路重要蛋白ACC1表達(dá)顯著升高，這些結(jié)果說明11β-HSD1過表達(dá)后，激活了脂質(zhì)合成通路，這可能是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)蓄積的原因之一。

4.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后脂質(zhì)合成相關(guān)基因含量變化 肝臟組織提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，小鼠肝臟組織脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平并沒有顯著改變(圖4)，說明脂質(zhì)合成通路的激活可能發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄后水平。

圖5 胰島素信號(hào)通路改變 A. Western blot檢測(cè)胰島素信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平；B. Western blot條帶灰度分析統(tǒng)計(jì)圖。注：n=10，*P<0.05，**P<0.01

圖4 脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)水平(n=10)

5.肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，降低了AKT、GSK磷酸化水平 本實(shí)驗(yàn)也對(duì)兩組小鼠肝臟組織胰島素信號(hào)通路進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，肝臟過表達(dá)11β-HSD1后，AKT和GSK的磷酸化水平相較于對(duì)照組明顯下降，P<0.05(圖5A～B)。上述結(jié)果表明，11β-HSD1過表達(dá)后，影響了胰島素信號(hào)通路，這有可能進(jìn)一步影響了脂代謝。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過肝臟過表達(dá)11β-HSD1，研究該基因?qū)χ|(zhì)蓄積的作用及其調(diào)控機(jī)制。結(jié)果顯示，肝臟脂質(zhì)蓄積而體質(zhì)量并未發(fā)生改變，這與肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，形成輕度脂肪肝，并伴隨胰島素抵抗[3]。然而在該研究中發(fā)現(xiàn)，雖然普通飲食能夠最終導(dǎo)致脂質(zhì)蓄積，但高脂飲食條件下并不能引起該轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟的脂質(zhì)增加，機(jī)制目前仍然不清楚[3]。本實(shí)驗(yàn)采用普通飲食喂養(yǎng)，長(zhǎng)鏈脂肪酸合成通路被激活，脂肪酸合成途徑的主調(diào)控因子SREBP1表達(dá)顯著增加，同時(shí)激活了下游通路FAS、SCD1的表達(dá)，脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白ACC1含量也顯著增加。這提供了一個(gè)11β-HSD1過表達(dá)后引起肝臟脂質(zhì)蓄積的解釋。為了進(jìn)一步闡明11β-HSD1如何調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成途徑，我們也同時(shí)檢測(cè)了上述基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，這些基因在mRNA水平?jīng)]有變化，說明11β-HSD1很可能是參與了長(zhǎng)鏈脂肪酸合成途徑中相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。這一結(jié)果得到了11β-HSD1肝臟特異性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[3]和肝臟敲低11β-HSD1的支持[6-7]。

肝臟脂質(zhì)蓄積與胰島素抵抗密切相關(guān)[8-10]。本實(shí)驗(yàn)通過蛋白免疫印跡檢測(cè)到p-AKT和p-GSK磷酸化水平降低，表明胰島素信號(hào)通路受損，胰島素敏感性降低，其機(jī)制可能是11β-HSD1通過活化區(qū)域性的糖皮質(zhì)激素鈍化了胰島素信號(hào)通路[11-12]，從而繼發(fā)地影響脂代謝紊亂。Alberts等[13]研究表明，采用選擇性抑制劑BVT.2733抑制11β-HSD1后，可顯著提高胰島素敏感性，這項(xiàng)研究間接支持了我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而最近Stefan等[14]在一個(gè)多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的人群研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過抑制劑RO509315112的12周治療后，可顯著改善脂肪肝，但并未提高肝臟胰島素敏感性。這些差異可能由遺傳背景或者抑制劑本身的特異性等原因所導(dǎo)致。

本實(shí)驗(yàn)通過尾靜脈注射腺病毒感染小鼠，腺病毒本身或可引起炎癥、肝腎毒性等不良反應(yīng)，故在后續(xù)的研究中我們將采用肝臟組織特異性11β-HSD1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)，對(duì)于脂質(zhì)蓄積我們重點(diǎn)探討了11β-HSD1對(duì)脂質(zhì)合成的影響，并未檢測(cè)脂質(zhì)吸收、分泌和β-氧化等其它因素，我們將在后續(xù)研究中繼續(xù)探討。此外，本課題組對(duì)11β-HSD1的上游調(diào)控因子TNFα的研究結(jié)果表明，TNFα處理HepG2可誘導(dǎo)11β-HSD1表達(dá)升高，進(jìn)一步誘發(fā)胰島素抵抗[15-16]，同時(shí)也引起脂質(zhì)蓄積。

本研究推測(cè)，11β-HSD1可能通過損傷胰島素信號(hào)通路，并激活脂肪酸合成通路而促進(jìn)小鼠脂肪肝形成。首次闡釋了瞬時(shí)過表達(dá)11β-HSD1可誘發(fā)肝臟脂質(zhì)蓄積，并損害胰島素信號(hào)通路。這為脂肪肝等代謝性疾病的防治提供了新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。