胡呂霖，任思婕，沈 清，陳健初*，葉興乾

（浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院，馥莉食品研究院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術研究重點實驗室，浙江省食品加工技術與裝備工程中心，浙江 杭州 310058）

烹調是常見的肉類熱處理方式之一。烹調加工有許多益處：高溫消滅致病菌、腐敗菌等有害微生物以保證肉類安全可食；賦予肉類良好的感官品質，如產(chǎn)生誘人香氣與可口滋味[1]；促使蛋白質變性以助消化。同時，烹調加工又不免帶來一些消極作用，如脂質、蛋白質氧化等一系列化學反應損害肉的感官品質與營養(yǎng)價值。

脂質氧化會使食品產(chǎn)生不良風味，也會產(chǎn)生有害物質，例如丙二醛（malondialdehyde，MDA）和4-羥基-2-壬烯醛（4-hydroxynon-2-enal，HNE）[2]。蛋白質的氧化會導致多種結構性變化，例如蛋白質分子交聯(lián)與聚集、側鏈殘基的氧化修飾等，影響蛋白質對消化酶的敏感性。因此，肉類蛋白的氧化可能會導致必需氨基酸損失、消化性減弱、氨基酸生物利用度降低及有害物質生成，從而損害肉蛋白的營養(yǎng)價值[3]。

除了烹飪加工使脂質與蛋白質發(fā)生氧化之外，熟肉在人體消化過程中，其組分會因消化液中促氧化因子（酸堿性、抗壞血酸、鐵離子等）的存在而繼續(xù)遭受氧化攻擊[4]，Estévez等[5]指出消化道中脂質與蛋白氧化產(chǎn)物的累積對人體健康具有潛在危害。已有許多文獻報道了烹飪加工對肉類脂質和蛋白質的氧化影響[6-8]，而熟肉中這些組分在消化道中的后續(xù)氧化，及這些氧化反應與蛋白質的消化性的相互作用仍有待探究。目前，體外消化法已經(jīng)被廣泛用于研究食物各組分在消化道中的降解、釋放及氧化變化[9-10]。

長久以來，魚類受人們的喜愛且是日常飲食中常見的食物，其豐富的優(yōu)質蛋白與多不飽和脂肪酸對人體有益。鱘魚，是亞洲重要的商業(yè)魚類，珍貴的魚子醬是其主要價值來源，而魚肉的利用率卻很低。實際上，鱘魚肉質地無骨、肉味鮮美，具有較好的食用價值。本研究以鱘魚為食材，將其進行水煮、汽蒸、微波加熱、烤箱烤、油炸5 種烹調處理，再通過體外模擬消化，測定經(jīng)烹調處理后及體外模擬消化后鱘魚肉中脂質與蛋白氧化情況，同時探究這些組分的氧化與蛋白質消化性之間的聯(lián)系，為建立魚類合理烹調方式，提高魚類營養(yǎng)價值提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鱘魚塊由浙江千島湖鱘龍科技股份有限公司提供，在冰塊包裹下2 h內送達實驗室。

4%～20%預制凝膠、上樣緩沖液、寬分子質量蛋白標準、二硫蘇糖醇、胃蛋白酶、胰酶 美國Sigma-Aldrich公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、5,5’-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DNTB）、2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS） 上海阿拉丁公司；改良Bradford蛋白含量測定試劑盒、考馬斯亮藍染色液 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

電磁爐 美的集團；JYL-C16V料理機 九陽股份有限公司；家用煮鍋 浙江蘇泊爾股份有限公司；微波爐、電蒸箱、電烤箱 寧波方太廚具有限公司；控溫油炸鍋 英聯(lián)斯特（廣州）餐飲設備有限公司；MA-150水分測定儀 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；K9860全自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；FSH-II型高速電動勻漿機 江蘇金壇市振興儀器廠；HH-10數(shù)顯恒溫攪拌水浴鍋 金壇市科杰儀器廠；電熱恒溫振蕩水浴鍋上海一恒科技有限公司；UV 2550紫外-可見分光光度計日本島津公司；Cary Eclipse熒光分光光度計 美國安捷倫公司；Multiskan GO全波長酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司；VE 180微型垂直電泳槽、EPS電泳儀、Tanon 2500R凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；innoLab 20P pH計 英國普律瑪儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱘魚烹飪方法

將冷凍鱘魚置于冰箱冷藏室（4 ℃）過夜解凍。將解凍后的魚肉切成大小相似的塊狀（7 cm×5 cm×1.5 cm）所有魚塊分成6 組：對照（生肉）、水煮處理、汽蒸處理、微波加熱、烤箱烤制、油炸處理。

1）水煮：將魚塊放入沸水中，煮制8 min后撈出，吸去表面水分。2）汽蒸：將魚塊整齊地擺放在帶孔不銹鋼盤中，將鋼盤放入電蒸箱內開始蒸制。電蒸箱溫度設置100 ℃，時間設定為8 min。結束后取出吸去表面水分。3）微波：將魚塊放入微波專用碗中，再放入微波爐中加熱。功率設定為800 W，加熱3 min后取出，翻面，再放入微波爐繼續(xù)加熱3 min。結束后取出吸去表面水分（油分）。4）烤制：將魚塊整齊地擺放于烤盤上，將烤盤放入電烤箱中?？鞠錅囟仍O定為200 ℃，加熱時間20 min（10 min后取出翻面，再放入烤箱）。結束后取出吸去表面油分。5）油炸：魚塊浸沒于預先加熱至180 ℃的大豆油中，油炸5 min。結束后取出吸去表面油分。

所有烹飪方式都以樣品中心溫度達約80～90 ℃為結束點，所有處理組樣品一式3 份。為單純研究烹飪方式對物料的影響，本實驗不額外添加其他調料。待樣品冷卻后，絞碎，包裝于塑封袋中置于-80 ℃冰箱以待后續(xù)檢測。檢測前，各類肉樣（裝于塑封袋中）均在室溫下解凍1 h。

1.3.2 體外模擬消化模型

稱取2 g肉樣依次經(jīng)過口-胃-腸三部分消化體系（各階段模擬消化液成分參照Van Hecke等[4]，具體如表1所示）先在3 mL模擬唾液中消化5 min，再加入5 mL模擬胃液（含胃蛋白酶），調pH 2.0±0.2，消化1 h ，最后加入5 mL模擬小腸液（含胰酶），調pH 8.0±0.2，消化2 h。整個消化過程，樣品置于37 ℃恒溫振蕩水浴鍋中。每種肉樣重復3 次消化實驗。分別留取胃消化后的與經(jīng)過整個消化過程的樣品，貯存于EP管中置于-80 ℃冰箱以待后續(xù)檢測。

表1 模擬消化液（唾液、胃液、小腸液）成分Table 1 Compositions of digestive juices used for in vitro digestion of fi sh samples

1.3.3 基礎成分分析

1.3.3.1 脂肪含量

參照Folch等[11]方法，稱取10 g肉樣，加入100 mL二氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶液，于55 ℃提取30 min，抽濾后于烘箱干燥，得到的產(chǎn)品稱量，計算脂肪質量分數(shù)，每個樣品重復實驗3 次，取平均值。

1.3.3.2 蛋白質含量

精確稱取0.200 0 g樣品于消化管中，加入0.2 g無水硫酸銅，3 g硫酸鉀，10 mL濃硫酸，再放入消化爐，于120 ℃消化40 min，240 ℃消化40 min，360 ℃消化1 h，420 ℃消化1 h，消化結束后冷卻至室溫后利用全自動凱氏定氮儀測定。每個樣品重復實驗3 次，取平均值。

1.3.3.3 水分含量

稱取約3 g肉樣，鋪平于樣品盤上，使用AM150快速水分測定儀測定，每個樣品重復3 次，取平均值。

1.3.4 硫代巴比妥酸（thiobarbituric reactive substances，TBARS）值測定

參考S u n等[12]方法，取2 g肉樣，加1 0 m L 10 g/100 mL的三氯乙酸（含0.1%乙二酸四乙胺）溶液，用組織高速勻漿機均質處理30 s（10 000 r/min），過濾，取濾液3 mL，加3 mL 0.02 mol/L TBARS溶液，100 ℃沸水浴中反應45 min，取出后冷卻至室溫，于532 nm波長處測定吸光度。所有樣品重復實驗3 次，結果用1 kg肉（干基）中MDA當量（以質量計）表示，單位為mg/kg。

1.3.5 蛋白總羰基值測定

參考Mercier等[13]的方法，即DNPH比色法。取2 g肉樣于10 mL含濃度0.6 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中勻漿，離心取上清液即為蛋白提取液。每0.4 mL的蛋白液（或消化液）加入0.2 mL含濃度10 mmol/L DNPH的2 mol/L的HCl溶液，30 ℃避光水浴l h（每隔10 min旋渦1 次）。充分反應后加入1 mL質量分數(shù)40%的三氯乙酸沉淀蛋白質，靜置20 min，13 000 r/min離心15 min，棄上層清液，用1 mL乙酸乙酯-乙醇（l∶1，V/V）洗滌沉淀，在13 000 r/min離心10 min以去除未反應的DNPH，重復上述洗滌過程，直至上清液為無色透明。用3 mL鹽酸胍溶液（6 mol/L）溶解沉淀，溶液于370 nm處測定羰基物質吸光度，并于278 nm波長處測定蛋白濃度。利用羰基分子吸光系數(shù)22 000 L/（mol·cm）計算羰基含量。實驗重復3 次，結果用1 mg蛋白中羰基物質的量表示，單位為nmol/mg。

1.3.6 游離巰基值測定

根據(jù)Morzel等[14]的方法測定巰基，即經(jīng)過適當修改的Ellman試劑法。取2 g肉樣于10 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 8.0）中勻漿，離心取上清液即為蛋白液。經(jīng)10 倍稀釋的蛋白質液樣（或消化液）加入0.02 mL 2 mmol/L DTNB，然后將混合液在25 ℃避光反應1 h，在412 nm波長處測定吸光度。利用巰基的分子吸光系數(shù)13 600 L/（mol·cm）計算巰基含量。實驗重復3 次，結果用1 g 肉（干基）中巰基物質的量表示，單位為nmol/g。

1.3.7 席夫堿類（Schiff bases，SB）物質測定

參考Gatellier等[15]的方法，取4 g肉樣于10 mL 20 mmol/L磷酸緩沖液（pH 6.5）中勻漿，離心取上清液。在四面透光比色皿中倒入3 mL上清液，放入Cary Eclipse熒光分光光度計中，對上清液進行380～600 nm的熒光發(fā)射光譜掃描（激發(fā)波長設定為360 nm，激發(fā)發(fā)射狹縫均為5 nm）。所有樣品重復2 次實驗。

1.3.8 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）

將各消化液樣品與上樣緩沖液以3∶1比例混合，于70 ℃水浴加熱10 min。制樣完畢后，在4%～20%預制膠的每孔中加入10 μL樣品，在150 V電壓下與Tricine SDS電解緩沖液中通電70 min。電泳結束后，取下膠片，用蒸餾水沖洗5 min，再用考馬斯亮藍R-250染色1.5 h。接著，用甲醇-乙酸-水（45∶10∶45，V/V）溶液進行脫色。最后用2500R凝膠成像系統(tǒng)對膠片進行拍照。

1.3.9 游離氨基測定

參考Adler-Nissen等[16]的方法，利用TNBS測定。取2 g肉樣于10 mL pH 8.0磷酸緩沖液中勻漿，離心取上清液即為蛋白液。取1 mL蛋白液（或消化液）與1 mL 0.5% TNBS溶液振蕩混勻，在50 ℃避光條件下水浴中反應1 h。隨后加入2 mL的0.1 mol/L鹽酸溶液終止反應，溶液在340 nm波長處測定吸光度。自由氨基含量根據(jù)甘氨酸含量的標準曲線確定。實驗重復3 次，結果用1 g肉（干基）中甘氨酸當量（以物質的量計）表示，單位為mol/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計

測定結果均以 ±s表示，方差分析進行Duncan’s差異分析，P值小于0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 烹飪及體外模擬消化對魚肉氧化的影響

2.1.1 烹飪方式及模擬消化階段對魚肉脂肪氧化的影響

圖1 不同烹飪方式下及消化前后的魚肉脂肪氧化情況Fig. 1 Lipid oxidation in sturgeon fi llets during cooking and in vitro digestion

如圖1所示，不同烹飪導致的脂肪氧化程度不同。水煮、汽蒸、微波加熱及油炸肉樣的TBARS值分別為0.73、0.72、0.92 mg/kg和0.77 mg/kg，均高于原料的0.61 mg/kg。然而，烤制魚肉中TBARS值（0.52 mg/kg）卻顯著低于原料及經(jīng)其他處理方式的肉樣，理論上，燒烤涉及長時間的高溫條件，應當加劇脂肪氧化，致使更多MDA等次級氧化產(chǎn)物生成，TBARS值增大。Utrera[17]及Roldan[18]等研究報道了類似結果，長時間高溫加熱下，肉中TBARS值反而會下降。原因可能是醛類等次級氧化產(chǎn)物會繼續(xù)降解成揮發(fā)性物質，除此之外，在長時間的高溫刺激下，醛類還會與肉中其他組分，如蛋白質相互結合，導致能與TBARS試劑反應的醛類減少，從而TBARS值降低。

經(jīng)模擬胃腸道消化后，各肉樣中的TBARS值相對于消化前都顯著升高，尤其在腸道消化過程中升高幅度更大。在胃消化階段，胃液的強酸環(huán)境與胃液中含有的抗壞血酸、金屬離子等助氧劑與催化劑，會促進脂質進一步氧化，并且消化前肉樣的TBARS值的高低會影響胃消化后TBARS值的高低，與Rysman等[19]研究結果一致。模擬腸消化過程中脂肪氧化比胃消化階段強烈，原因可能如下：脂質在含脂肪酶的模擬胰液中水解，產(chǎn)生大量游離脂肪酸，而游離脂肪酸比酯化的脂肪酸更容易遭受氧化?？局频娜鈽咏?jīng)過消化后TBARS仍較低，推測雖然消化過程中脂質氧化加強，但是生成更多的醛類轉變成揮發(fā)性物質，或與蛋白質等其他組分相互作用。

2.1.2 烹飪方式及模擬消化階段對魚肉蛋白羰基產(chǎn)物的影響

羰基化是蛋白氧化最顯著的特征之一。本實驗中羰基含量通過DNPH法測得，結果如圖2所示。經(jīng)水煮、汽蒸的樣品中羰基含量比原料增加了近1 倍，微波加熱的樣品中羰基含量增加了約2 倍，而烤制與油炸樣品中的羰基含量增加程度顯著高于其他烹飪方式。本實驗結果與許多研究相一致，Traore等[20]研究了水煮過程中豬肉的蛋白氧化情況，與原料肉相比，煮后熟肉蛋白的羰基值較高，且30 min水煮處理后的羰基值高于10 min水煮。Gatellier等[21]用不同溫度的蒸汽對牛肉加熱，在高溫下（肉表面溫度達207 ℃），羰基產(chǎn)物增加為原料肉的6 倍。

圖2 不同烹飪方式下及消化前后的魚肉蛋白羰基產(chǎn)物含量變化Fig. 2 Changes in protein carbonyl level in sturgeon fi llets during cooking and in vitro digestion

蛋白羰基產(chǎn)物可通過許多途徑形成，最主要的是以下兩條：1）賴氨酸、精氨酸等側鏈氨基酸直接氧化引進羰基基團；2）與脂肪氧化產(chǎn)物，如HNE、MDA等非蛋白來源的羰基物質，發(fā)生加成作用[19]?？局茦悠方?jīng)長時間高溫加熱，羰基含量大量增加在意料之中，而在油炸處理的情況下，肉中的蛋白暴露于油脂的機會大大增加，考慮到油脂氧化會促進蛋白氧化，所以除了途徑1之外，途徑2引起的羰基含量增加也成為主要原因。

如圖2所示，胃和腸消化后，樣品羰基含量相比未消化肉樣顯著升高，且不同階段各肉樣之間的含量變化趨勢是類似的，即消化前后，羰基含量最高的均是經(jīng)燒烤處理的肉樣，而羰基含量最低的均是原料肉。模擬小腸消化過程中，蛋白質羰基增加幅度更大，原因可能是上述途徑2起了更重大的作用，因為脂肪氧化在這一階段也更為劇烈（圖1），生成更多醛類與蛋白質發(fā)生間接氧化。

蛋白質羰基化會影響肉類的營養(yǎng)價值，除了一些必需氨基酸因羰基化而損失之外，羰基基團還可與其他氨基酸殘基或其他羰基形成交聯(lián)，生成希夫堿結構和羥醛縮合產(chǎn)物[19]，這些交聯(lián)會促使蛋白質聚集進而影響蛋白質消化性。

2.1.3 烹飪方式及模擬消化階段對魚肉游離巰基值的影響

含硫氨基酸（半胱氨酸與甲硫氨酸）易氧化生成多種產(chǎn)物，如次磺酸、亞磺酸與磺酸等硫氧化合物與二硫鍵交聯(lián)產(chǎn)物[23]。因此游離巰基含量常用來表示蛋白氧化程度，即游離巰基損失越多代表氧化程度越高。

圖3 不同烹飪方式下及消化前后的魚肉游離巰基含量變化Fig. 3 Changes in free thiol level in sturgeon fi llets during cooking and in vitro digestion

本實驗中，經(jīng)不同烹飪方式后的肉樣都損失了較多游離巰基（圖3），與蒸煮、微波加熱肉樣相比，烤制與油炸樣品中游離巰基損失程度最大，約為40%。此結果與國內外其他研究相一致，如Hernández-lópez等[24]對豬肉水煮后，發(fā)現(xiàn)巰基損失了約50%，同時二硫鍵含量增加。但是也有研究人員發(fā)表了不同結果，Promeyrat等[25]發(fā)現(xiàn)加熱過程中，蛋白質的游離巰基含量會呈現(xiàn)兩階段變化，可能由于初始階段高溫使二硫鍵斷裂，巰基增多，而隨著加熱時間延長，巰基氧化損失嚴重。

與未消化的樣品相比，經(jīng)胃消化后的樣品游離巰基含量顯著增加（增幅約為50%），趨勢與消化前一致，推測在胃蛋白酶作用下部分水解的蛋白分子結構展開，使更多被掩蓋的巰基基團暴露于外與DTNB試劑反應。

雖然胃階段中，游離巰基含量大幅度增加，但在腸消化階段中又大量減少，甚至顯著低于肉樣消化前的巰基數(shù)量，表明巰基在腸消化期間氧化程度嚴重，并且從結果來看似乎不受烹飪方式的影響。原因可能是，在腸消化液中胰酶的作用下，蛋白較為徹底的水解使得大量半胱氨酸或含半胱氨酸的短肽釋放出來，暴露于消化液中遭受ROS等自由基攻擊。

2.1.4 脂質與蛋白質相互作用——SB含量

SB的生成可表征脂質與蛋白的相互氧化作用。蛋白質的游離氨基（賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺等側鏈殘基）可與醛類等脂質氧化產(chǎn)物發(fā)生加成反應形成含R—C＝N—的物質[26]，其熒光特性較強，因此可利用熒光光譜法分析其含量。

不同烹飪處理后的肉樣提取液的熒光光譜圖呈現(xiàn)不同形態(tài)，如圖4所示，蒸和煮方式對肉樣熒光特性影響較小，只是略微提高，而烤制與油炸處理的肉樣的熒光強度大幅度增加，幾乎是原料肉的10 倍。Gatellier等[15]加熱牛肉至表面溫度分別達65、96、207 ℃，探究烹飪過程中蛋白與脂肪氧化的關系。結果表明溫度越高，SB含量越多，蛋白總羰基含量越高，而TBARS值則先升后降，猜測蛋白與脂質氧化產(chǎn)物醛類可能發(fā)生了加成反應，從而形成含SB結構的物質。胃腸道消化會進一步促進SB生成，在小腸消化中此現(xiàn)象更為明顯，主要原因可能是，蛋白質與脂質在胰酶作用下中充分降解，釋放大量游離脂肪酸與氨基酸，使兩者之間的接觸機會大大增加，從而促進SB大量生成。并且烤制與油炸的樣品消化后SB含量仍是最高，消化后的SB含量與消化前的初始值關系很大。

另外，原料肉及水煮、汽蒸、微波加熱肉樣的熒光譜圖帶有2 個峰（405、515 nm），而油炸與烤制的肉樣提取物的光譜只顯示一個峰，峰形變寬，且從原來的405 nm紅移向425 nm處，此紅移現(xiàn)象同時發(fā)生在消化前后的樣品光譜圖中，原因可能是SB的大量增多，兩個峰相互重疊，致使第2個小峰消失不見，峰的位移則表明不同烹飪方式及模擬消化過程會導致含有不同復雜結構的SB生成，但確切結構還有待解析。SB結構與其他交聯(lián)的形成會促進蛋白質聚集，影響蛋白質的消化率。

圖4 不同烹飪方式下及消化前后的魚肉的熒光特性變化Fig. 4 Emission fl uorescence spectra (formation of Schiff bases) of extracts from sturgeon fi llets during cooking and in vitro digestion

2.2 烹飪及體外模擬消化對魚肉蛋白消化性的影響

2.2.1 SDS-PAGE

在不添加胃蛋白酶的模擬胃液中消化1 h后，與原料肉相比，不同烹飪方式后的魚肉蛋白條帶有所變化（圖5）。原料肉與水煮、汽蒸、微波加熱肉樣的蛋白條帶相對清晰，而烤制、油炸樣品中，大于50 kDa的條帶處比較模糊。最顯著的變化則是經(jīng)烹飪處理后，樣品的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）有所損失，原料肉中MHC含量豐富，而水煮，汽蒸的樣品蛋白中MHC含量雖減少，但仍相對較高，微波后樣品的MHC有所減少，而油炸與烤制導致大量MHC損失。以下兩種原因可解釋上述現(xiàn)象：1）蛋白分子的聚集使分子過大而無法進入膠內[27]；2）受熱分解成較小的蛋白分子。有些條帶（如40 kDa附近的條帶）在各種烹飪方式后幾乎保持不變，表明這些蛋白質即使在烤制與油炸等劇烈條件下也相當穩(wěn)定。經(jīng)不添加胰酶的模擬腸道消化后，各樣品的條帶與只經(jīng)胃消化后略有差別，主要由于蛋白質在不同pH值的消化液中溶解度不同。

圖5 經(jīng)不同烹調加工的鱘魚肉體外模擬消化后的SDS-PAGE圖Fig. 5 Representative SDS-PAGE patterns of proteins from raw and cooked sturgeon fi llets after simulated gastrointestinal digestion

在模擬胃消化后（含有胃蛋白酶），各消化液的SDS-PAGE條帶如圖5所示，與經(jīng)過烹飪處理的樣品差別最大的是，原料肉在胃蛋白酶消化后，分子質量小于45 kDa的條帶依然清晰可見且含量豐富，表明仍有大量蛋白或肽未被水解，而熟肉中 這部分蛋白或肽更容易被酶解。此外，不同烹飪方式后的肉樣的胃消化產(chǎn)物也存在差別，雖然各樣品電泳圖中分子質量50～130 kDa的條帶都仍較清晰，但烤制與油炸樣品這部分條帶相比蒸煮樣品顏色更深，微波樣品介于之間，說明烤制與油炸的肉樣在胃蛋白酶作用下仍有大量大分子蛋白存在。

不同烹飪方式對蛋白質在胃消化階段的影響機制如下：一方面，原料肉蛋白相對緊湊的空間結構使得其對胃蛋白酶作用的抵抗性較強，而熟肉蛋白對消化酶的敏感性取決于蛋白質的氧化狀態(tài)。由于蒸煮的溫和條件誘導的熱變性及較弱的氧化引起蛋白質部分展開，使胃蛋白酶更容易地進入水解位點[28]。而烤制與油炸等劇烈條件下，蛋白質氧化程度加重，更傾向于發(fā)生交聯(lián)與聚集，增加了大分子質量的肽含量，形成致密結構，抵抗酶蛋白水解，從而抑制胃酶對蛋白的進一步水解[29]。

模擬胃腸道消化3 h后，不論是原料肉還是經(jīng)不同烹調處理的肉的消化液在電泳圖上均沒有可見的條帶，僅在14 kDa或更低的分子質量下觀察到一片模糊，表明經(jīng)胃酶部分消化的蛋白質在胰蛋白酶作用下充分水解，只剩下一些小肽。僅從SDS-PAGE分析，不同烹飪方式對蛋白在模擬腸消化階段的水解情況影響并不明顯。

2.2.2 游離氨基值

雖然SDS-PAGE從分子質量層面表征了各類肉樣的蛋白水解程度，但分子質量非常小的肽（＜6.5 kDa）卻不能被準確地檢測到。TBNS法被廣泛用于測定蛋白質的游離氨基，與SDS-PAGE結合可以更好地表征蛋白質的消化性。

圖6 不同烹飪方式下及消化前后的鱘魚肉游離氨基含量變化Fig. 6 Proteolysis in sturgeon fi llets during cooking and in vitro digestion

生魚肉中游離氨基的含量相對較高，而經(jīng)烹調處理的肉樣游離氨基含量較低（圖6）。烹飪后游離氨基的損失可歸因于與醛反應生成了SB，此與熒光強度的增加結果相互印證（圖4）。不同烹飪方式對魚肉蛋白水解程度有較大影響。

經(jīng)過胃消化階段，蛋白水解程度與未消化相比顯著增加，且經(jīng)蒸煮方式的樣品的游離氨基含量高于其他樣品，經(jīng)烤制與油炸的肉樣水解程度最低。此結果與SDSPAGE條帶結果相互印證，原因也如前所述。

與胃階段相比，小腸消化階段游離氨基大幅度增加，說明蛋白質主要在腸道中消化，與前面SDS-PAGE圖所一致，胃消化后仍有大量蛋白或肽類，而腸消化后無可見條帶。經(jīng)模擬胃腸道消化后，熟肉蛋白釋放的游離氨基量相比原料肉少，說明蛋白質消化性降低，與Rysman[19]、Kaur[30]等研究結果一致?？紤]到蛋白質大量水解而發(fā)生結構崩塌，氧化誘導緊密結構形成致使蛋白酶不能酶切位點這個原因可被排除，更可能是由于多種氨基酸殘基或酶切位點的修飾導致了消化酶無法識別位點，此外，考慮到在模擬胃腸道消化后SDS-PAGE圖中沒有觀察到條帶，推斷一些較小的肽段不能被進一步水解。

3 結 論

本實驗采用不同烹調方式均促進了鱘魚肉蛋白與脂質的氧化，表現(xiàn)在蛋白羰基產(chǎn)物增加，TBARS值升高，BS增加與游離巰基大量損失，5 種烹飪方式中，油炸與烤制方式造成的氧化程度最大。而烤制樣品中TBARS值降低，總羰基和SB大量增多則表明蛋白質與脂質的相互作用強烈。另外，這些氧化反應會在胃腸道消化過程中持續(xù)進行。概括而言，胃消化過程中的氧化主要歸因于胃液的低pH值及許多促氧化劑的存在，而腸道消化中，脂質和蛋白質的水解釋放大量游離氨基和脂肪酸，促進這些組分的氧化及相互作用。

蛋白質氧化會引起蛋白質的展開或聚集，從而對蛋白質消化率有影響。SDS-PAGE條帶與游離氨基含量測定的結果表明在消化前不同烹飪方式引起的蛋白質氧化對胃消化過程中的蛋白水解產(chǎn)生不同影響，這可歸因于部分氧化的蛋白質結構展開與嚴重氧化的蛋白質分子發(fā)生聚集，分別促進與抑制了酶解作用。而在整個胃腸道消化后，仍存在一些較短的肽段難以被徹底水解。