孫東源　張銘陽　王嵐

[摘要]目的 研究組蛋白去甲基化酶KDM3A在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達差異以及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 用于免疫組化的乳腺癌組織及正常乳腺組織均來源于沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，收集2013～2015年的乳腺癌石蠟標(biāo)本，患者均為女性。采用免疫組化SP法檢測100例乳腺癌、30例正常乳腺組織中KDM3A的表達情況。分析KDM3A的表達與患者年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、腫瘤分期、瘤體大小以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 KDM3A在乳腺癌組織中的陽性率為89.0%（89/100），在正常乳腺組織中的陽性率為66.7%（20/30），KDM3A在乳腺癌中的表達高于正常乳腺組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；KDM3A的表達與瘤體的大小以及ER表達有相關(guān)性。結(jié)論 乳腺癌組織中KDM3A呈高表達，且與腫瘤瘤體的大小以及ER表達有相關(guān)性，提示KDM3A可能在ER陽性乳腺癌中發(fā)揮促進乳腺癌生長及增殖作用。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌；去甲基化酶；KDM3A；免疫組化

[中圖分類號] R730.23 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）6（c）-0004-03

[Abstract]Objective To study the difference of the expression of histone demethylation enzyme KDM3A in breast cancer tissue and normal breast tissue and its relationship with clinicopathological characteristics.Methods The breast cancer tissues and normal breast tissues used in immunohistochemistry were derived from the Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College.The paraffin specimens of breast cancer were collected from 2013 to 2015，all of which were women.The expression of KDM3A in 100 cases of breast cancers and 30 cases of normal breast tissues was detected by using immunohistochemical SP method.The relationship between the expression of KDM3A and the clinicopathological features of patients′age，estrogen receptor （ER），progesterone receptor （PR），tumor stage，tumor size and lymph node metastasis were analyzed.Results The positive rate of KDM3A in breast cancer tissues was 89.0% （89/100），and the positive rate of KDM3A in normal breast tissue was 66.7% （20/30）.The expression of KDM3A in breast cancer was higher than that of normal breast tissue，with statistically significant difference （P<0.05）.The expression of KDM3A was related to the size of the tumor and the expression of ER.Conclusion The high expression of KDM3A in breast cancer tissue is related to the size of tumor and the expression of ER，suggesting that KDM3A may play a role in promoting the growth and proliferation of breast cancer in ER-positive breast cancers.

[Key words]Breast cancer；Demethylation enzyme；KDM3A；Immunohistochemistry

乳腺癌是嚴重危害女性健康的常見腫瘤，發(fā)病率逐年上升，是引起女性死亡的重要原因[1-2]。我國乳腺癌每年新增病例占世界新發(fā)病例的12.2%，每年乳腺癌死亡病例占總死亡的9.6%[3-4]。其發(fā)病過程呈現(xiàn)一個多因素、多基因參與的復(fù)雜過程。在乳腺癌確診病例中約有2/3為雌激素受體（ER）陽性的乳腺癌，因此深入研究ER信號通路的影響因素，有助于全面揭示ER陽性乳腺癌的發(fā)病機制，為ER陽性乳腺癌的治療提供新的靶點。

近年來的研究顯示，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展與表觀遺傳的變化密切相關(guān)。KDM3A作為JMJD家族中的一員[5]，是目前研究比較深入的去甲基化酶。KDM3A通過其去甲基化酶的功能，特異性催化H3K9me1/2的去甲基化，從而解除組蛋白抑制效應(yīng)而調(diào)節(jié)基因表達，實現(xiàn)促進乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的作用[6]。目前KDM3A表達與乳腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系尚未見報道。本研究利用免疫組化的方法檢測了KDM3A在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達，分析KDM3A與臨床病理特征的關(guān)系，探索其在乳腺癌發(fā)病過程中的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料和試劑

乳腺癌及正常乳腺組織標(biāo)本來源于沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院，KDM3A鼠抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，SP免疫組化試劑盒和DAB顯色液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.2檢測方法

免疫組化染色采用SP法，置65℃恒溫烤箱烘烤4 h后，石蠟切片經(jīng)脫蠟，抗原修復(fù)，血清封閉，加鼠抗人KDM3A（滴度1︰500）置4℃孵育過夜，室溫復(fù)溫后反復(fù)磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗；加生物素標(biāo)記的二抗，室溫10 min，PBS沖洗，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素親和素復(fù)合物孵育，PBS沖洗，DAB染色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。實驗中應(yīng)用已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3結(jié)果判定

KDM3A染色以細胞核出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。無陽性細胞為0分，陽性細胞1%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。細胞無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。高倍鏡下隨機選3個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，每例切片至少評價1000個細胞。然后根據(jù)兩者的乘積判斷陽性等級，0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為中度陽性，9～12分為強陽性。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 KDM3A在正常乳腺組織及乳腺癌組織中的表達

KDM3A蛋白在乳腺癌組織中的陽性率為89.0%（89/100），在正常乳腺組織中的陽性率為66.7%（20/30），兩者陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.2 KDM3A蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

KDM3A在乳腺癌組織中呈高表達（圖1），這一結(jié)果提示KDM3A可能與臨床病理特征有相關(guān)性。本實驗進一步分析了KDM3A蛋白表達與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，KDM3A表達和瘤體的大小、ER表達具有相關(guān)性（P<0.05），和患者年齡、組織學(xué)分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER2、Ki67及脈管及軟組織侵犯無明顯關(guān)聯(lián)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表2）。

3討論

KDM3A擁有廣泛的生物學(xué)功能，參與多種生物學(xué)過程，包括核受體激活、精子生成、能量代謝、低氧調(diào)節(jié)和癌癥發(fā)生等[7-9]。迄今為止，文獻報道顯示，KDM3A在多種腫瘤中呈高表達，通過多種途徑促進腫瘤的進程。有文獻報道，在前列腺癌中KDM3A的表達高于鄰近組織，且差異顯著[10]。近期研究顯示，KDM3A通過調(diào)控雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性，參與前列腺癌的進程[11]。在肺腺癌細胞中，KDM3A調(diào)控Foxp 3的轉(zhuǎn)錄水平，增加抑制性細胞因子的分泌，促進肺腺癌細胞的免疫逃逸[12]。KDM3A經(jīng)由其下游靶基因MCAM促進尤因肉瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。KDM3A與其共激活因子HIF1α共同增強糖酵解途徑，促進膀胱癌的進程[14]。對大腸癌的研究顯示，癌癥組織中KDM3A的表達量明顯增高，使用RNA干擾技術(shù)下調(diào)KDM3A表達可顯著降低大腸癌細胞系的增殖能力和侵襲力[15]。腎癌組織KDM3A的表達量顯著高于癌旁組織[16]。KDM3A調(diào)節(jié)卵巢癌的干性和耐藥性[17]，促進非小細胞肺癌的腫瘤發(fā)生[18]。此外，KDM3A除作為雄激素受體的共激活蛋白外，研究顯示KDM3A還參與了雌激素受體調(diào)控的基因表達激活過程，作為雌激素受體的調(diào)節(jié)因子，促進雌激素受體下游靶基因的表達[6，9]。

本研究結(jié)果顯示，KDM3A在乳腺癌中的陽性率為89.0%，在正常乳腺組織中的陽性率為66.7%，KDM3A在乳腺癌組織中呈高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示KDM3A可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。臨床病理特征的分析顯示，KDM3A的高表達與瘤體的大小和ER表達具有相關(guān)性。KDM3A可能通過調(diào)節(jié)ER信號通路，發(fā)揮促進乳腺癌生長的作用。KDM3A的高表達可能預(yù)示著快速的腫瘤生長，是一個預(yù)后不良的指標(biāo)，因此KDM3A有望成為乳腺癌治療的新靶點。

[參考文獻]

[1]令狐銳霞，司文，李瑩，等.3846例乳腺癌流行病學(xué)及臨床病理學(xué)分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015，36（10）：1017-1021.

[2]蘇亞梅，楊鑫，彭偉偉，等.云南省乳腺癌患者臨床流行病學(xué)特征分析[J].中外醫(yī)療，2015，20（2）：99-102.

[3]Fan L，Kathrin SW，Jun JL，et al.Breast cancer in China[J].Lancet Oncol，2014，15（7）：e279-e289.

[4]賀立彩，朱真鋒，鄭倩倩，等.ACTL8 的表達與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].中國病理生理雜志，2016，32（6）：1138-1141，1146.

[5]郭曉強，馬克世.組蛋白去甲基化酶JMJD家族的特點和功能[J].生命的化學(xué)，2008，28（3）：275-278.

[6]Wade MA，Jones D，Wilson L，et al.The histone demethylase enzyme KDM3A is a key estrogen receptor regulator in breast cancer[J].Nucleic Acids Res，2015，43（1）：196-207.

[7]Okada Y，Tateishi K，Zhang Y，et al.Histone demethylase JHDM2A is involved in male infertility and obesity[J].J Androl，2010，31（1）：75-78.

[8]Krieg AJ，Rankin EB，Chan D，et al.Regulation of the histone demethylase JMJD1A by hypoxia-inducible factor1α enhances hypoxic gene expression and tumor growth[J].Mol Cell Biol，2010，30（1）：344-353.

[9]Garcia-Bassets I，Kwon YS，Telese F，et al.Histone methylation-dependent mechanisms impose ligand dependency for gene activation by nuclear receptors[J].Cell，2007，128（3）：505-518.

[10]Suikki HE，Kujala PM，Tammela TL，et al.Genetic alterations and changes in expression of histone demethylases in prostate cancer[J].Prostate，2010，70（8）：889-898.

[11]Wilson S，F(xiàn)an L，Sahgal N，et al.The histone demethylase KDM3A regulates the transcriptional program of the androgen receptor in prostate cancer cells[J].Oncotarget，2017，8（18）：30328-30343.

[12]Li Y，Yang W，Wu B，et al.KDM3A promotes inhibitory cytokines secretion by participating in TLR4 regulation of Foxp 3 transcription in lung adenocarcinoma cells[J].Oncol Lett，2017，13（5）：3529-3537.

[13]Sechler M，Parrish JK，Birks DK，et al.The histone demethylase KDM3A，and its downstream target MCAM，promote Ewing Sarcoma cell migration and metastasis[J].Oncogene，2017，36（29）：4150-4160.

[14]Wan W，Peng K，Li M，et al.Histone demethylase JMJD1A promotes urinary bladder cancer progression by enhancing glycolysis through coactivation of hypoxia inducible factor 1[J].Oncogene.2017，36（27）：3868-3877.

[15]Uemura M，Yamamoto H，Takemasa I，et al.Jumonji domain containing 1A is a novel prognostic marker for colorectal cancer：in vivo identification from hypoxic tumor cells[J].Clin Cancer Res，2010，16（18）：4636-4646.

[16]Guo X，Shi M，Sun L，et al.The expression of histone demethylase JMJD1A in renal cell carcinoma[J].Neoplasma，2011， 58（2）：153-157.

[17]Ramadoss S，Sen S，Ramachandran I，et al.Lysine-specific demethylase KDM3A regulates ovarian cancer stemness and chemoresistance[J].Oncogene，2017，36（11）：1537-1545.

[18]Zhan M，Wen F，Liu L，et al.JMJD1A promotes tumorigenesis and forms a feedback loop with EZH2/let-7c in NSCLC cells[J].Tumour Biol，2016，37（8）：11237-11247.

（收稿日期：2018-04-12 本文編輯：祁海文）