楊 丹，唐 靜，沈文擁，吳 濤，劉愛民，鄧明明

(1. 重慶市涪陵中心醫(yī)院，重慶 408000；2. 瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000)

重癥急性胰腺炎(SAP)是臨床上常見的急腹癥，占整個急性胰腺炎的10%～20%，具有病死率高、并發(fā)癥多和預(yù)后差等特點[1-2]。急性腎衰竭(ARF)是SAP最主要的并發(fā)癥之一，亦是導致SAP患者死亡、住院時間延長和住院費用提高的主要原因之一，其發(fā)生率為14%～43%[3-4]。目前針對SAP合并ARF尚無特效療法。中藥川芎的有效成分川芎嗪可調(diào)節(jié)細胞凋亡，清除氧自由基，調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)的釋放和增加臟器微循環(huán)血流量，廣泛用于各種疾病的治療[5-6]。本研究觀察了川芎嗪注射液對SAP大鼠腎細胞的保護作用，旨在為SAP合并ARF的臨床治療提供更多參考依據(jù)。

1 實驗資料

1.1實驗動物 45只健康雌性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，由陸軍醫(yī)科大學附屬大坪醫(yī)院動物實驗中心提供，標準顆粒混合飼料喂養(yǎng)。

1.2試劑及儀器 0.6%川芎嗪注射液(無錫第七制藥廠)，兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗體和Bax多克隆抗體(SantaCruz公司)，DAB顯色試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)，原位細胞凋亡(TUNEL)試劑盒(美國Roche公司)。光學顯微鏡(BX60，日本Olympus公司)，全光譜分光光度儀(VARIOSKAN10-240VAC，德國Eppendorf公司)，離心機(5415D，德國Eppendorf公司)，全自動生化分析儀(Hitachi 7060，日本Olympus公司)， 超低溫冰箱 (8571型 ，美國Forma儀器公司)，光學攝像系統(tǒng)(AX-70，日本Olympus公司)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYH-DHS-50X65-B-Ⅱ，上海躍進醫(yī)療器械廠)，微量加樣槍( Eppendorf，德國Eppendorf公司)

1.3實驗方法 將45只雌性SD大鼠隨機分為正常組、模型組和川芎嗪組，每組15只。模型組和川芎嗪組以4%?；悄懰徕c經(jīng)腹腔逆行胰膽管注射方法制備SAP模型，空白組大鼠開腹后翻動腸壁即關(guān)腹。術(shù)后10 min正常組、模型組大鼠尾靜脈注射生理鹽水10 mL/kg，川芎嗪組大鼠尾靜脈注射0.6%川芎嗪注射液10 mL/kg。

1.4觀察指標

1.4.1血清淀粉酶(AMY)、尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)水平 分別于術(shù)后12 h、24 h和48 h，每組隨機選取5只SD大鼠各抽取股動脈血5 mL，置于生化管中，用于檢測血清AMY、BUN和Cr水平。

1.4.2腎組織HE染色病理表現(xiàn) 分別于術(shù)后12 h、24 h和48 h，每組隨機抽取5只SD大鼠處死，留取約1.0 cm3腎實質(zhì)組織并置于4%甲醛中固定，脫水，常規(guī)石蠟切片包埋，進行HE染色，光鏡下觀察腎組織的病理形態(tài)學。采用Rabb法[2]評估腎臟組織損傷情況，其中單種改變病理損傷范圍>75%記為4分，單種改變病理損傷范圍>25%～75%記為3分，單種改變病理損傷范圍5%～25%記為2分，單種改變病理損傷范圍<5%記為1分，無病理損傷記為0分。常見病理變化包括腎小管上皮細胞水腫、壞死、脫落，腎間質(zhì)炎癥及水腫，基底膜斷裂再生，腎小球皺縮，腎小囊擴張，近曲小管的刷狀緣丟失等。

1.4.3腎組織細胞凋亡指數(shù) 取1.4.2項下腎組織進行免疫組織化學染色，參照文獻[1]及試劑盒說明操作。采用TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡情況，以細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，統(tǒng)計腎臟標本內(nèi)陽性細胞數(shù)及顯色度，陽性強度用半定量法：陽性細胞>75%記為3分，陽性細胞51%～75%記為2分，陽性細胞10%～50%記為1分，陽性細胞<10%記為0分；細胞著棕褐色為3分，著黃色為2分，著淺黃色為1分，不著色為0分。兩者積分乘積>4分為中強度陽性()，1～4分為弱陽性(+)，0分為陰性(-)。

1.4.4腎組織中Bcl-2及Bax蛋白表達情況 采用Western Blot法檢測。取3塊大小約1.0 cm3腎實質(zhì)組織冷凍于-196 ℃液氮灌內(nèi)，逐步解凍后，剪碎組織并勻漿，加入Western裂解液提取蛋白，4 ℃ 12 000 r/min離心取上清液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品，在10%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，100 V電轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。后加入50 g/L脫脂牛奶封閉2 h，再稀釋一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗滌膜3次，將辣根過氧化物酶標記的二抗1∶2 000稀釋后加入孵育，洗膜后ECL法顯色劑顯色并照相。用凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，GAPDH為參比。

2 結(jié) 果

2.13組大鼠血清AMY、BUN及Cr水平比較 正常組大鼠各時間血清AMY、BUN及Cr水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間血清AMY、BUN、Cr水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠血清AMY、BUN、Cr水平均顯著提高(P均<0.05)，但川芎嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1～3。

表1 3組大鼠術(shù)后不同時間點血清AMY水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組大鼠腎臟實質(zhì)組織HE染色病理表現(xiàn) 正常組大鼠術(shù)后各時間點腎臟組織未見異常，見圖1。模型組大鼠術(shù)后12 h HE染色顯示腎小管上皮細胞中重度腫脹，腎小球毛細血管淤血；術(shù)后24 h顯示腎小管上皮細胞腫脹，少量壞死，細胞界限不清，炎細胞浸潤，可見間質(zhì)水腫，腎小球毛細血管淤血；術(shù)后48 h顯示腎小管上皮細胞腫脹，明顯壞死，大量炎癥細胞浸潤，間質(zhì)明顯水腫，腎小球毛細血管明顯淤血，見圖2。川芎嗪組大鼠術(shù)后各時間點腎小管上皮細胞腫脹程度、細胞壞死數(shù)量、炎細胞浸潤及間質(zhì)水腫程度均較模型組輕，見圖3。模型組和川芎嗪組大鼠腎臟組織損傷病理評分顯著高于正常組(P均<0.05)，但川芎嗪組顯著低于模型組(P均<0.05)，見表4。

表2 3組大鼠術(shù)后不同時間點血清BUN水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表3 3組大鼠術(shù)后不同時間點血清Cr水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.33組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)比較 凋亡細胞主要位于腎小管上皮細胞，胞質(zhì)和胞核染成棕褐色，腎間質(zhì)和腎小球凋亡細胞較少。正常組大鼠術(shù)后各時間點凋亡指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間點凋亡指數(shù)均明顯高于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠凋亡指數(shù)均顯著提高(P均<0.05)，但川芎嗪組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表5。

圖1 正常組大鼠術(shù)后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 模型組大鼠術(shù)后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖3 川芎嗪組大鼠術(shù)后不同時間點腎臟組織HE染色表現(xiàn)(×400)

組別12h24h48h正常組49.98±0.920.47±0.610.42±0.39模型組56.42±0.63①8.019±1.22①7.982±1.66①川芎嗪組54.12±1.01①②4.986±0.72①②6.023±0.72①②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表5 3組大鼠腎組織細胞凋亡指數(shù)比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.43組大鼠腎組織中Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較 正常組大鼠各時間腎組織中Bcl-2、Bax蛋

白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；模型組和川芎嗪組大鼠各時間Bax蛋白表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平均明顯低于正常組(P均<0.05)，且隨著時間延長，模型組和川芎嗪組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達水平變化越顯著(P均<0.05)，但川芎嗪組Bax蛋白表達水平均明顯低于模型組而Bcl-2蛋白表達水平均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖4和表6。

1和2為正常組；3～5為模型組；6～8為川芎嗪組圖4 3組大鼠腎組織中 Bcl-2、Bax 蛋白表達情況

組別Bax12h24h48hBcl-212h24h48h正常組1.008±0.0151.006±0.0181.009±0.0060.816±0.0060.819±0.0040.818±0.002模型組1.020±0.021①1.028±0.028①1.043±0.010①0.593±0.004①0.627±0.009①0.695±0.017①川芎嗪組1.015±0.028①②1.019±0.025①②1.028±0.020①②0.722±0.008①②0.731±0.013①②0.774±0.011①②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

川芎嗪是從中藥川芎中分離的一種生物堿，其可改善微循環(huán)和凝血障礙，增大毛細血管口徑，促使血流增快及血流增加，促進開放毛細血管數(shù)增多并抑制白細胞游走；可降低感染性壞死性SAP患者炎癥遞質(zhì)如白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平，減輕炎癥反應(yīng)對組織的損害；可減輕大鼠實驗性腎小球腎炎基底膜損傷，減少滲出，阻抑新月體形成，減少蛋白尿，改善腎功能；還能促進糖尿病腎病受損內(nèi)皮細胞功能修復(fù)，進而延緩糖尿病腎病進展7-10。本實驗結(jié)果顯示，模型組和川芎嗪組大鼠術(shù)后各時間血清AMY、BUN、Cr水平均明顯高于正常組，但川芎嗪組均明顯低于模型組；HE染色結(jié)果顯示，川芎嗪組大鼠術(shù)后不同時間點腎小管上皮細胞腫脹程度、細胞壞死數(shù)量、炎細胞浸潤及間質(zhì)水腫程度均明顯輕于模型組，病理評分明顯低于模型組，提示川芎嗪具有保護SAP致腎損傷大鼠腎臟功能作用。

既往關(guān)于SAP大鼠腎損傷的研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠的腎臟組織細胞凋亡增加，RT-PCR檢測表現(xiàn)為促凋亡基因Bax上調(diào)及抑凋亡基因Bcl-2下調(diào)，提示Bax和Bcl-2可能參與SAP的腎臟損害過程[11-13]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腎臟組織的細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達水平均明顯高于正常組，Bcl-2蛋白表達水平明顯低于正常組，提示SAP腎損傷與Bcl-2和Bax蛋白異常表達相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致；川芎嗪組大鼠術(shù)后不同時間點腎臟細胞凋亡指數(shù)、Bax蛋白表達水平明顯低于模型組，Bcl-2蛋白表達水平明顯高于模型組，表明川芎嗪可以抑制或減少SAP大鼠腎小管上皮細胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護作用，可能機制在于上調(diào)Bcl-2蛋白表達和相對下調(diào)Bax蛋白表達。胡旭光等[14]研究顯示，川芎嗪能夠通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2表達，下調(diào)軟骨細胞促凋亡因子Bax以及Caspase-3表達而抑制軟骨細胞的凋亡。李中華等[15]研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可通過促進Bcl-2抑制Bax表達延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮。韓嬌艷等[16]實驗發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可通過調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax表達影響前列腺癌PC3細胞增殖及凋亡。宣柳等[17]報道，川芎嗪可通過調(diào)控Bcl-2和Bax蛋白抑制AA大鼠滑膜細胞的異常增殖，誘使滑膜細胞凋亡。從上述研究可見，川芎嗪調(diào)節(jié)Bcl-2及Bax表達并不具有組織特異性，這也可能是川芎嗪具有廣泛藥理作用的原因之一。

綜上所述，川芎嗪對SAP所致的腎損傷具有保護作用，其可能機制為促進Bcl-2蛋白表達，下調(diào)Bax蛋白表達，抑制腎小管上皮細胞凋亡，這為川芎嗪臨床用于SAP 的治療提供了一定理論依據(jù)。