龐潛潛 李長征 王業(yè)全 劉 奇 侯秀迪 崔 文Δ
(1濟寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心,2濟寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院,濟寧 272067)
短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)是一類在人類基因組中分布非常廣泛的DNA長度多態(tài)性遺傳標(biāo)記,一般是2~6個堿基串聯(lián)重復(fù)排列形成。因為STR的核心序列的重復(fù)次數(shù)的不同,使得STR具有極高的多態(tài)性。STR基因座等位基因命名來源就是其核心序列的重復(fù)次數(shù),遵循孟德爾遺傳規(guī)律,在親權(quán)鑒定和個體識別中應(yīng)用非常廣泛,目前常用于分型的STR基因座多為4核苷酸重復(fù)的STR位點,個別位點是5核苷酸重復(fù)。在實踐中,聯(lián)合使用多個STR可以產(chǎn)生數(shù)億的基因型組合,而每一種組合在群體中出現(xiàn)的頻率都非常低,可以在很高的概率水平上認(rèn)定嫌疑人。因此,STR基因座的PCR分型目前是國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)親緣鑒定和個體識別最主要的技術(shù)。歐盟法醫(yī)DNA 分型標(biāo)準(zhǔn)化委員會認(rèn)為,雖然近些年新的技術(shù)與新的遺傳標(biāo)記在不斷地涌現(xiàn),但在今后相當(dāng)長時期內(nèi),STR 將仍然是法醫(yī)學(xué)應(yīng)用最主要的遺傳標(biāo)記[1]。
唐氏綜合征(Down syndrome,DS)即21三體綜合征,又稱為先天愚型,是最常見的染色體數(shù)量異常疾病之一,表現(xiàn)為嚴(yán)重智力低下及發(fā)育異常,新生兒發(fā)病率約1/600~1/800[2],患兒在出生時即表現(xiàn)出特殊面容。唐氏綜合征主要是卵子減數(shù)分裂時 21 號染色體不分離,形成異常卵子導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙引起的[3]。目前正常孕檢項目已包括唐氏篩查項目,并且唐篩高危人群可以選擇羊水穿刺或者無創(chuàng)DNA技術(shù)進一步確認(rèn)胎兒染色體數(shù)目是否正常。D21S11和Penta D是位于21號常染色體上的兩個距離較近的STR基因座,相距大約25Mb,D21S11是一個四核苷酸重復(fù)的STR位點,Penta D是一個五核苷酸重復(fù)的STR位點,在法醫(yī)學(xué)21三體綜合征鑒定中具有重要應(yīng)用價值[4-6]。
受檢樣本來自濟寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心法醫(yī)物證實驗室受理的親權(quán)鑒定案件。樣品采集時間為2018年4月10日,樣品為血樣,F(xiàn)TA卡采集,室溫存放。具體案情為:被檢母親妊娠期唐氏篩查檢測結(jié)果顯示低風(fēng)險,但是考慮到被檢母親為高齡產(chǎn)婦(38歲),增加了無創(chuàng)DNA檢測項目進行確定。無創(chuàng)DNA檢測結(jié)果未顯示有21三體綜合征等遺傳疾病的風(fēng)險,被檢母親生產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)新生兒出現(xiàn)21三體綜合征患兒的特殊面容,因此需進行DNA檢測以確定新生兒是否為21三體綜合征患兒。被檢母親現(xiàn)場抽血(以下稱為被檢母親)并提供了自稱為新生兒的血樣檢材(以下稱為血樣檢材)。
PCR擴增儀(AB公司,美國);ABI-3500遺傳分析儀(AB公司,美國);GeneMapper ID-X 1.4軟件(AB公司,美國);Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒(基點認(rèn)知公司,中國);華夏TM白金PCR擴增試劑盒(AB公司,美國)。
1.3.1Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒檢測 用Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒復(fù)合擴增Amelogenin基因座和19個STR基因座(D19S433,D5S818,D21S11,D18S51,D6S1043,D3S1358,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1P0,Penta D,vWA,D8S1179,TPOX,Penta E,TH01,D12S391,D2S1338,F(xiàn)GA)。使用ABI 9700(金座)熱循環(huán)儀,反應(yīng)體系為10μl,含 H2O 3.84μl、PCR Reaction Mix 4.0μl、引物2.0μl、FTA卡打孔0.5mm、 Gold Taq 酶(5U/μl)0.16μl。PCR反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性2min;94℃ 5s,60℃ 70s,共27個循環(huán)后;60℃延伸30min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2華夏TM白金PCR擴增試劑盒檢測 華夏TM白金PCR擴增試劑盒復(fù)合擴增Amelogenin基因座和22個STR基因座(D19S433,D5S818,D21S11,D18S51,D6S1043,D3S1358,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1P0,Penta D,vWA,D8S1179,TPOX,Penta E,TH01,D12S391,D2S1338,F(xiàn)GA,D22S1045,D10S1248,D1S1656)。使用ABI 9700(金座)熱循環(huán)儀,反應(yīng)體系為10μl,含 PCR Reaction Mix 4.0μl、引物4.0μl、Prep-n-go 2.0μl,F(xiàn)TA卡打孔0.5mm。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1min;94℃ 3s,59℃ 16s,65℃ 29s,共27個循環(huán)后;60℃延伸5min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.3結(jié)果判定 用ABI 3500分析儀進行毛細(xì)管電泳,通過GeneMapper ID -X 1.4 軟件進行結(jié)果分析。檢測結(jié)果通過計算親權(quán)指數(shù)(paternity index,PI)、累積親權(quán)指數(shù)(cumulative paternity index,CPI), 遵循孟德爾遺傳定律判定血樣檢材與被檢母親是否親生關(guān)系。STR基因座出現(xiàn)3個等位基因熒光峰,峰值面積比值為1∶1∶1 時,或者出現(xiàn)兩個等位基因熒光峰,峰值面積比為2∶1或1∶2 (或出現(xiàn)峰值面積未達到2∶1/1∶2,但<0.65或者>1.8)時,或者出現(xiàn)1 個峰且峰面積是相鄰雜合子單峰峰面積3倍時,制定為三等位基因。
對被檢母親現(xiàn)場抽取的血樣及其提供的血樣檢材進行常規(guī)親子鑒定所用的Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒進行擴增,擴增后STR分型。見表1。
血樣檢材STR分型結(jié)果顯示:該血樣檢材包括D19S433在內(nèi)的19個常染色體STR基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源。但是D21S11和Penta D這兩個基因座的STR分型出現(xiàn)異常,均出現(xiàn)了3個峰,為三等位基因(圖1)。被檢母親的D21S11和Penta D這兩個基因座的等位基因分型正常(圖1)。通過與相應(yīng)的Cadder進行比較結(jié)果顯示(圖2、圖3):D21S11和Penta D兩個基因座出現(xiàn)的3個等位基因峰沒有顯著差別,與Cadder的峰位置能夠完全對應(yīng),并且與被檢母親對應(yīng)的峰位置相同,這就說明這兩個位點的STR分型結(jié)果能夠確定為三等位基因。
表1 Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒基因座分型結(jié)果
圖1 被檢母親和血樣檢材的Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒STR分型結(jié)果
圖2 Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒D21S11基因座比對結(jié)果
圖3 Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒Penta D基因座比對結(jié)果
為了確認(rèn)Goldeneye 20A的STR得到的三等位基因的分型結(jié)果,被檢母親及血樣檢材通過華夏TM白金PCR擴增試劑盒擴增進行驗證,以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴增后STR分型結(jié)果見表2。
血樣檢材STR分型結(jié)果顯示:該血樣檢材包括D3S1358在內(nèi)的23個常染色體STR基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源,與Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒分型結(jié)果一致的是D21S11和Penta D這兩個基因座的STR分型依然是存在3個等位基因峰(圖4)。通過與相應(yīng)的Cadder進行比較,結(jié)果也可以明顯看出:D21S11和Penta D兩個基因座出現(xiàn)的三個等位基因峰沒有顯著差別,峰的位置與Cadder能夠?qū)?yīng),并且與被檢母親的對應(yīng)峰位置也相同,再一次說明這兩個位點的STR分型結(jié)果為三等位基因。見圖5、6。
表2 華夏TM白金PCR擴增試劑盒基因座分型結(jié)果
圖4 被檢母親和血樣檢材的華夏TM白金PCR擴增試劑盒STR分型結(jié)果
圖5 華夏TM白金PCR擴增試劑盒D21S11基因座比對結(jié)果
圖6 華夏TM白金PCR擴增試劑盒Penta D基因座比對結(jié)果
在本案件親權(quán)關(guān)系鑒定過程中,被檢母親及其提供的新生兒血樣(血樣檢材)通過Goldeneye 20A PCR擴增試劑盒進行擴增,STR分析的結(jié)果顯示:血樣檢材各個基因座的等位基因均可以從被檢母親中找到來源,符合孟德爾遺傳定律。
但是血樣檢材中的D21S11(28/29/30)和Penta D(12/13/14)這兩個基因座的STR分型均出現(xiàn)了3個等位基因,并且D21S11和Penta D都位于第21號染色體。為了確認(rèn)該結(jié)果,排除實驗過程中操作引起分型異常,我們進一步用華夏白金試劑盒PCR擴增分型進行驗證,結(jié)果顯示:血樣檢材中D21S11和Penta D這兩個基因座的STR分型依然出現(xiàn)了3個等位基因,除此之外的其他染色體上的位點STR分型均是正常的二等位基因,以此可以推斷該血樣檢材來自21三體綜合征患者。經(jīng)過案情回訪調(diào)查發(fā)現(xiàn),該新生兒已經(jīng)進行了染色體檢查,共檢測了50個核型,其中48個核型存在三條21號染色體(見圖7),這就進一步確證了該新生兒是21三體綜合征患者。
圖7 核型診斷結(jié)果
STR分型結(jié)果顯示被檢母親的19個STR位點分型是正常的,另據(jù)被檢母親敘述,該新生兒父親也沒有21三體綜合征的相關(guān)表現(xiàn)。一般情況下,來源于父親減數(shù)分裂失敗的染色體三體十分少見[7],這說明了該新生兒的3條21號染色體可能是由于減數(shù)分裂時的21號染色單體分離失敗導(dǎo)致的。由于并不能確認(rèn)該新生兒的第3條21號染色體的來源,因此累計親權(quán)指數(shù)的計算較為復(fù)雜,需多加注意[8]。
在親權(quán)鑒定中,有時候會出現(xiàn)某一基因座有3個帶型或者3個等位基因分型的STR結(jié)果,這一現(xiàn)象可能是由于拷貝數(shù)變化、染色體數(shù)目異常(18染色體三體,21染色體三體等)或者是引物的結(jié)合區(qū)發(fā)生突變導(dǎo)致的[9],因此需要多個試劑盒進行擴增,并對多個試劑盒的檢測結(jié)果進行綜合判斷,排除干擾因素,確認(rèn)該STR分型結(jié)果。三帶型基因座的三個峰高可能相同也可能不同,21三體樣本檢驗中除出現(xiàn)3條帶外,還可能出現(xiàn)2條或1條帶[10]。出現(xiàn)3條帶判型較易判別,而當(dāng)出現(xiàn)2個峰,但峰面積之比為2∶1或出現(xiàn)1個峰且峰面積是相鄰雜合子單峰峰面積3倍時,應(yīng)注意排除本癥。本文通過多位點STR復(fù)合擴增技術(shù)的兩種試劑盒相互驗證,確定21號染色體上的兩個基因座D21S11和Penta D確實為三等位基因,并且結(jié)合已有的染色體核型檢測結(jié)果確定該血樣來自21三體綜合征患者。
在親權(quán)關(guān)系鑒定或個體識別過程中,如果出現(xiàn)三等位基因現(xiàn)象一定要非常重視,需要使用不同的擴增試劑盒和重復(fù)檢測驗證分型結(jié)果[11-12],以排除污染和泳道滲漏等導(dǎo)致誤判的問題。