邵玉銘 李國良 丁潤濤 王 旭 馬 莉

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，濟(jì)寧272067；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，濟(jì)寧 272011)

胎兒宮內(nèi)窘迫是指因各種因素導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)缺氧，嚴(yán)重者導(dǎo)致胎兒死亡，為產(chǎn)科工作中較為常見的病癥，在臨床中常以持續(xù)正壓通氣輔以肺泡表面活性物質(zhì)治療[1]。表面活性蛋白A、B(SP-A、SP-B)由肺泡Ⅱ型細(xì)胞和Clara 細(xì)胞分泌，是表面活性物質(zhì)重要成分。機(jī)體正常呼吸的維持有賴于肺泡表面活性物質(zhì)對肺泡表面張力的降低。當(dāng)表面活性物質(zhì)分泌減少或缺失時，肺泡因表面張力過大導(dǎo)致塌陷，無法進(jìn)行有效的氣體交換而造成死亡[2-4]。在法醫(yī)病理學(xué)尸體檢驗工作中常常受理到新生兒死亡案例，尸檢后發(fā)現(xiàn)此類新生兒肺泡發(fā)育均正常，且肺內(nèi)全都有羊水吸入情況，只是在吸入量上有所差異。而在臨床實踐中不乏羊水吸入新生兒救治成功案例，這表明羊水吸入量與肺泡表面活性物質(zhì)分泌量對于此類患兒生存有重要關(guān)系，然而臨床上缺乏客觀的可觀測指標(biāo)和診斷標(biāo)準(zhǔn)，無法準(zhǔn)確判斷救治方式和程度，難免會出現(xiàn)診治不當(dāng)抑或過度治療情況，反而造成不必要的醫(yī)療損害甚至死亡[5-6]。

本文對存在羊水吸入的新生兒尸檢標(biāo)本進(jìn)行羊水成分吸入量和肺泡表面活性物質(zhì)分泌量測定，并對兩者之間的關(guān)系作出客觀評價，以提高法醫(yī)病理學(xué)鑒定準(zhǔn)確率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本文選自2014年1月至2018年1月濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬第一人民醫(yī)院及濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心鑒定完畢的總計87例羊水吸入死亡的新生兒肺組織蠟塊(AFI組)，同期選取31例非羊水吸入死亡的足月新生兒的肺組織蠟塊作為對照組。AFI組男38例，女49例；對照組男14例，女17例。所有標(biāo)本的HE染色切片經(jīng)復(fù)診后均符合組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 病例入選和排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)：所有新生兒均為7日內(nèi)解剖、雙肺標(biāo)本完整獨(dú)立固定；AFI組均為經(jīng)過濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心鑒定確診為羊水吸入致死的新生兒；對照組均為非羊水吸入致死，死因包括機(jī)械性窒息因素、出血性疾病、感染性疾病。

排除標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病母親、先天畸形、嚴(yán)重遺傳代謝性疾病以及早產(chǎn)兒。

1.3 HE染色與免疫組織化學(xué)染色

石蠟組織連續(xù)切片，常規(guī)HE染色應(yīng)用伊紅蘇木素，羊水成分著紅色；免疫組織化學(xué)染色以 EDTA 溶液進(jìn)行抗原修復(fù)，采用 SP 法進(jìn)行免疫組化染色。一抗均為鼠抗人單克隆抗體工作液，SP-A、SP-B抗體購自中杉金橋生物技術(shù)公司。其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，最后經(jīng) DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。以 PBS 代替一抗作陰性對照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

常規(guī)HE染色應(yīng)用伊紅蘇木素，羊水成分著紅色。SP-A、SP-B在胞漿表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞質(zhì)和分泌的表面活性物質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性表達(dá)，其陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：計算5個高倍視野中陽性細(xì)胞所占的比例；-：陽性細(xì)胞<5%；+：5%≤陽性細(xì)胞<30%；++：30%≤陽性細(xì)胞<60%；+++：陽性細(xì)胞≥60%。肺泡腔內(nèi)見到羊水成分即認(rèn)定為羊水吸入，陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：計算肺組織5個低倍視野中含有羊水成分的肺泡數(shù)量所占比例；+(少量)：陽性肺泡<10%；++(多量)：10%≤陽性肺泡<20%；+++(大量)：陽性肺泡≥30%。本文中將免疫組織化學(xué)結(jié)果+、++、+++合并為陽性，以簡化數(shù)據(jù)處理。每張病理切片均由2位法醫(yī)病理鑒定人雙盲法閱片，其對案例資料均不了解。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件采用SSPS19.0軟件包，用χ2檢驗分析羊水吸入和非羊水吸入新生兒死亡案例肺組織中SP-A、SP-B蛋白表達(dá)的是否存在差異性。采用Spearman等級相關(guān)法檢驗羊水成分吸入量和肺泡表面活性物質(zhì)分泌量之間是否存在相關(guān)性，α=0.05 作為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組羊水成分情況

對照組所有肺組織肺泡腔較大，擴(kuò)張明顯，細(xì)支氣管及肺泡腔內(nèi)均干凈，而AFI組細(xì)支氣管及肺泡腔內(nèi)均可見多量紅染的胎糞樣小體、毳毛及角化上皮等羊水成分，肺泡腔不大、未充分?jǐn)U張,大多數(shù)為腺樣肺泡，肺間隔較厚；細(xì)支氣管上皮排列紊亂,呈不同程度增生；細(xì)支氣管腔內(nèi)有脫落的上皮和多量胎糞樣小體、毳毛及角化上皮。見圖1。

注：A.對照組羊水成分情況；B.AFI組羊水成分情況； ↑代表角化上皮；↑代表毳毛，↑代表胎糞樣小體

2.2 兩組SP-A、SP-B表達(dá)情況

SP-A、SP-B表達(dá)陽性細(xì)胞胞質(zhì)和分泌的表面活性物質(zhì)中呈棕黃色顆粒著色，在肺泡Ⅱ型細(xì)胞、分泌的表面活性物質(zhì)和呼吸性支氣管上皮細(xì)胞表達(dá)。

AFI組中，存在羊水成分的肺泡、呼吸性支氣管上皮SP-A,SP-B表達(dá)呈弱陽性，分布少而散在。對照組中SP-A、SP-B表達(dá)相對均勻，所有病例均有陽性表達(dá)。見圖2。

注：A.對照組肺泡SP-A表達(dá)情況;B.對照組肺泡SP-B表達(dá)情況； C.AFI組肺泡SP-A表達(dá)情況;D.AFI組肺泡SP-B表達(dá)情況

2.3 兩組肺組織SP-A、SP-B陽性表達(dá)情況

與對照組相比，AFI組 SP-A、SP-B蛋白的陽性表達(dá)率顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組間SP-A、SP-B在肺組織中陽性表達(dá)情況比較(n/%)

2.4 羊水成分吸入量和肺泡表面活性物質(zhì)分泌量相關(guān)情況

87例羊水吸入肺組織中，SP-A陽性表達(dá)率為40.2%(35/87)，SP-B陽性表達(dá)率為41.4%(36/87)，羊水吸入量分別為：38(+ 少量，陽性肺泡<10%)，32(++ 多量，10%≤陽性肺泡<20%)，17(+++ 大量，陽性肺泡≥30%)，Spearman等級相關(guān)法檢驗表明羊水吸入和肺泡表面活性物質(zhì)分泌量呈相關(guān)性(rSSP-A=-0.818,P<0.05；rSSP-B=-0.829,P<0.05)。見表2、表3。

表2 羊水成分吸入量和SP-A分泌量之間的相關(guān)情況

表3 羊水成分吸入量和SP-B分泌量之間的相關(guān)情況

3 討論

AFI是新生兒特別是早產(chǎn)兒死亡的常見疾病，多見宮內(nèi)窘迫兒。病理特點是在肺泡腔內(nèi)可見多量胎糞樣小體、毳毛及角化上皮，肺泡腔不大、未充分?jǐn)U張,大多數(shù)為腺樣肺泡，肺間隔較厚；細(xì)支氣管上皮排列紊亂,呈不同程度增生；細(xì)支氣管腔內(nèi)有脫落的上皮和多量胎糞樣小體、毳毛及角化上皮。本文在HE染色下可見AFI組中有大量的羊水成分存在和攣縮肺泡，新生兒不能完成氣體交換，引起缺氧缺血，最終導(dǎo)致呼吸衰竭死亡。有研究認(rèn)為羊水吸入與新生兒肺發(fā)育不成熟、表面活性蛋白減少有關(guān)[7-8]。肺泡表面活性物質(zhì)主要成分是磷脂、類脂和一些表面特異性活性蛋白(SP)。SP-A、SP-B是減小表面張力的主要功能蛋白，能插入到氣-液界面的磷脂單分子層，降低肺泡表面張力[9]。SP-A、SP-B由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和支氣管Clara細(xì)胞分泌，隨著胚胎發(fā)育、肺組織成熟而表達(dá)增強(qiáng)，人胚胎18周開始在支氣管樹表達(dá)。本文觀察到AFI組肺泡上皮SP-A、SP-B表達(dá)明顯減少，與對照組相比，差異明顯，說明在發(fā)生羊水吸入后，肺泡表面活性物質(zhì)分泌減少，同時通過比較AFI組內(nèi)羊水吸入量與SP-A、SP-B表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，肺內(nèi)羊水吸入的量越多，其肺泡上皮SP-A、SP-B的表達(dá)越少，二者相關(guān)性分析呈明顯負(fù)相關(guān)，分析認(rèn)為這與新生兒肺發(fā)育不良，特別是早產(chǎn)兒肺泡結(jié)構(gòu)不成熟，導(dǎo)致SP-A、SP-B的分泌量少[10-11]，但本文的結(jié)果表明，SP-A、SP-B的分泌量與羊水吸入量之間呈現(xiàn)線性相關(guān)的特點，故本文認(rèn)為羊水成分對于肺泡上皮存在一定的影響，抑制或減少表面活性物質(zhì)的分泌，從而導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)減少，進(jìn)而引起肺不張抑或通氣障礙。具體是羊水里面哪種成分影響了肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞和支氣管Clara細(xì)胞分泌功能尚有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，或可對推進(jìn)臨床治療宮內(nèi)窘迫和羊水吸入新生兒產(chǎn)生極大的幫助。