王海英 亞白柳 王文淼 劉文彥△

(1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院行為醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)寧 272067)

針刺在中國已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)千年，是中國傳統(tǒng)醫(yī)術(shù)的一種。電針是結(jié)合了現(xiàn)代技術(shù)后的產(chǎn)物，它是指在毫針針刺的基礎(chǔ)上輸入脈沖電流[1]，來達(dá)到治病的目的[2]。電針技術(shù)已廣泛應(yīng)用到缺血性腦損傷的臨床治療中。缺血性腦損傷的發(fā)病率高，其死亡率已居于我國疾病死亡原因的前6位[3]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對機(jī)體的內(nèi)、外環(huán)境的變化極為敏感，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 ( glucose regulated protein,GRP78)通常被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物，可以促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的修飾和正確折疊，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能具有保護(hù)作用[4]；caspase12是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的促凋亡因子，正常狀態(tài)下與GRP78結(jié)合，而過強(qiáng)的刺激可使caspase12激活，啟動(dòng)凋亡通路[5]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察電針對大鼠腦缺血-再灌注不同時(shí)間的GRP78和caspase12表達(dá)的變化以及肢體運(yùn)動(dòng)功能的修復(fù)情況，探討電針的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SPF級SD大鼠，雄性，體重(220±10)g，購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司(合格證號：SCXK魯20130001)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)前自由喂食和飲水，飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，恒定濕度(50±5)%，12h循環(huán)光照，以維持基礎(chǔ)狀態(tài)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵循國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理?xiàng)l例和使用指南以及濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。caspase12 mRNA RT-PCR擴(kuò)增和GRP78免疫熒光實(shí)驗(yàn)(只有3h、6h、12h和24h組)：SD大鼠隨機(jī)分為對照組(sham組，5只)、腦缺血-再灌注組(I/R組，30只)和再灌注時(shí)間點(diǎn)+電針組(I/R+EA組，30只)，I/R組按再灌注時(shí)間點(diǎn)分為3h、6h、12h、24h、72h、120h 6個(gè)亞組，每組5只，I/R+EA組根據(jù)I/R各亞組時(shí)間點(diǎn)對應(yīng)分為6組，每組5只。大鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀實(shí)驗(yàn)：35只SD大鼠隨機(jī)分為sham組(5只)、I/R組(15只)和I/R+EA組(15只)，I/R組和I/R+EA組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)7d、14d和30d各分為3個(gè)亞組，每組5只。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備[6]制備MCAO模型，按照Longaⅴ級評分法于術(shù)后清醒1h后給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評分，1～3分的動(dòng)物為模型制備成功。

1.2.2電針方法[7]大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，于再灌注開始后30min，對“水溝”和“百會(huì)”穴進(jìn)行電針刺激，持續(xù)30min，最后一次電針結(jié)束后30min取材。

1.2.3肢體運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)[8]各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后3h統(tǒng)一進(jìn)行評分，選擇評分4～5級的大鼠為疲勞棒實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?dòng)物，I/R+EA組大鼠每天電針治療1次、30min，連續(xù)電針干預(yù)7d，對再灌注7d、14d和30d組的大鼠進(jìn)行疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)，40轉(zhuǎn)/min，各組分別于術(shù)前進(jìn)行訓(xùn)練，選擇能在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留2min以上的大鼠，分別于術(shù)后第2天開始，每天訓(xùn)練2次，分別于再灌注7d、14d和30d進(jìn)行疲勞轉(zhuǎn)棒測試，每只大鼠測5次，記錄大鼠在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上停留的時(shí)間，取平均值，最長停留時(shí)間為15min即停止疲勞轉(zhuǎn)棒儀，觀察大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)狀況。

1.2.4RT-PCR檢測caspase12 mRNA 用DNAstar軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 caspase12 mRNA引物序列

1.2.5GRP78免疫熒光實(shí)驗(yàn) 制備冰凍切片，厚度12 μm，加入GRP78一抗工作液，4℃過夜，加入熒光二抗，PI工作液室溫復(fù)染，激光共聚焦顯微鏡觀察FITC標(biāo)記的陽性反應(yīng)物[8]。FITC是波長為488 nm藍(lán)色激發(fā)光，波長為515 nm的綠色觀測光。每個(gè)鼠腦標(biāo)本選取不連續(xù)的4張切片，每張切片計(jì)數(shù)4個(gè)視野， 取細(xì)胞計(jì)數(shù)的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能指標(biāo)變化

I/R+EA組(7 d和14 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間與對應(yīng)的I/R組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；I/R+EA組(30 d)大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時(shí)間與對應(yīng)I/R組相比變化不明顯(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間(秒，

2.2 各組大鼠腦組織caspase12 mRNA表達(dá)情況

與sham組相比，腦缺血-再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和120 h后大鼠腦組織中caspase12在mRNA水平上的表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針干預(yù)后caspase12 mRNA的表達(dá)與I/R組相比顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

2.3 大鼠腦組織GRP78的表達(dá)情況

3h、6h 、12h、24h I/R+EA組大鼠缺血部位腦組織GRP78陽性細(xì)胞數(shù)和對應(yīng)的I/R組比較顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表4。

表3 3組間caspase12 mRNA的表達(dá)

注：胞漿內(nèi)GRP78陽性呈綠色，60×，1為sham組； 2、3、4和5為3 h、6 h、12 h和24 hI/R組；6、7、8和9為對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)I/R+EA組。

表4 3組間GRP78陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/視野，

3 討論

腦血管病是臨床上的常見病，其中缺血性腦卒中所占的比例最高，嚴(yán)重危害了人類生命及健康。近幾年，對于缺血性腦卒中的治療及機(jī)制方面的研究取得很大的進(jìn)展[10]。腦缺血區(qū)分為急性缺血中心區(qū)和周圍缺血半暗區(qū)[11]，腦缺血損傷側(cè)大腦半暗帶廣泛存在凋亡現(xiàn)象，以缺血損傷側(cè)大腦皮層及紋狀體為甚，神經(jīng)元對缺氧刺激因素比較敏感，可發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞壞死。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，參與機(jī)體許多重要生理功能的維持，包括信號肽的識別、糖基化修飾以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載等[9,12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常敏感，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列反應(yīng)時(shí)，都可以導(dǎo)致ER功能障礙，比如：糖基化抑制、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)異常[13]、二硫鍵形成障礙等，即發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)[14]。在許多分子伴侶蛋白的協(xié)助下，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)可以發(fā)生正確折疊，其中，分子伴侶蛋白包括Bip/Grp78(immunoglobulin binding protein78)和Grp94(glucose-regulated protein94)等。Hayashi 等[15]認(rèn)為,GRP78 而非GRP94決定了神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能促進(jìn)IRE1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子CHOP基因表達(dá)和caspase12的激活，參與凋亡的過程[16]。

疲勞轉(zhuǎn)棒儀實(shí)驗(yàn)?zāi)芡ㄟ^對大鼠運(yùn)動(dòng)功能的測試，觀察大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)狀態(tài)，包括大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力和肢體力量，是反應(yīng)神經(jīng)功能的修復(fù)情況的很好的行為學(xué)指標(biāo)。本文結(jié)果顯示，電針干預(yù)可以幫助大鼠修復(fù)肢體的運(yùn)動(dòng)功能及肢體協(xié)調(diào)能力，從而促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)；腦缺血-再灌注損傷后腦組織中caspase12在mRNA表達(dá)上調(diào)，所對應(yīng)的再灌注時(shí)間點(diǎn)，經(jīng)電針干預(yù)后caspase12 mRNA的表達(dá)明顯降低；腦缺血-再灌注損傷后大鼠腦細(xì)胞GRP78表達(dá)明顯升高，電針干預(yù)后GRP78的表達(dá)顯著降低；電針干預(yù)后能下調(diào)缺血側(cè)腦組織中GRP78和caspase12 mRNA的表達(dá)。GRP78和caspase12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路的關(guān)鍵因子，GRP78的過度表達(dá)能使神經(jīng)元對缺血性損傷的敏感性增強(qiáng)，加速神經(jīng)元的損傷；caspase-12位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞漿面，能與其他內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子協(xié)同，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；最新的研究顯示，caspase12也能獨(dú)立引發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，我們推斷電針促進(jìn)缺血性腦損傷大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能修復(fù)可能與阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡通路有關(guān)。

綜上所述，電針干預(yù)能通過降低腦細(xì)胞內(nèi)caspase12 mRNA和GRP78的表達(dá)幫助修復(fù)大鼠肢體的運(yùn)動(dòng)功能，發(fā)揮腦保護(hù)作用，為探討電針治療缺血性中風(fēng)的作用機(jī)制提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。