畢秀芳，陳麗伊，趙彩霞，車振明

（西華大學食品與生物工程學院，四川省食品生物技術重點實驗室，四川 成都 610039）

果汁是目前最受歡迎的飲料之一，尤其是一些復合果汁深得消費者喜愛[1-2]。隨著果汁逐漸成為市場的消費熱點，人們對其品質的要求也越來越高，而一些內源酶的存在會嚴重影響果汁的品質[3]。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）可以將脫酯果膠酸的α-（1-4）糖苷鍵隨機水解為小片段，從而降解植物組織，影響果蔬汁的黏度和濁度[4]。雖然傳統的熱處理能有效鈍酶，但同時會造成果蔬汁中一些熱敏性營養(yǎng)成分如VC的損失[5]。非熱處理技術能提高果蔬汁品質并確保安全性，且不會對營養(yǎng)物質造成不利影響[6]。如今，國內外學者對食品加工的研究已經從傳統的熱處理向非熱處理技術轉化[7]。

超聲波技術（ultrasound，US）是一項新型的非熱殺菌技術，能有效殺滅食品中的微生物，并且能保持食品的品質[8-9]。其中高場強超聲波是指頻率在20～100 kHz，功率密度在10～1 000 W/cm2范圍內的超聲波技術，在食品加工中最為常用，并受到各國學者的高度關注[10-11]，其主要作用原理是空化效應和機械效應[12-13]。現今，超聲波鈍酶的研究已有較多報道，主要集中在多酚氧化酶[14-15]、過氧化物酶[16-17]、果膠甲基酯酶[18-19]和脂肪氧化酶[20-21]。Ma等[22]研究了不同超聲波條件對PG的激活效果。然而目前對超聲波對PG的鈍化動力學研究較少，且缺乏熱與超聲波對酶鈍化的相互關系的報道。因此，本研究以PG為研究對象，設計了熱與超聲波單獨處理、同時處理、先后處理3 組實驗，研究了不同溫度、不同超聲功率密度對PG的鈍化動力學。為超聲波鈍化PG提供理論數據，并為果蔬汁加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PG（8 600 PGNU/g） 諾維信（中國）投資有限公司；多聚半乳糖醛酸（生物技術級，純度85%） 源葉生物科技有限公司；D-半乳糖醛酸 北京索萊寶科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）為化學純，其余試劑均為分析純，購自成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

SCIENTZ-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；FMB40制冰機 上海豫明儀器有限公司；WFJ7200分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；MC-01000228 pH計 成都世紀方舟科技有限公司；HH-S4水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

DNS試劑：用400 mL蒸餾水溶解3.15 g DNS，逐步加入200 mL NaOH溶液（0.5 mol/L），再加入91 g四水酒石酸鉀鈉、2.5 g苯酚、2.5 g無水亞硫酸鈉，35 ℃溫水浴，不斷攪拌，直至溶液清澈透明。用蒸餾水定容至1 000 mL，保存在棕色瓶中。與二氧化碳隔絕，貯存期為6 個月。

0.5 mol/L的pH 5.0醋酸-醋酸鈉緩沖液：先分別配制0.5 mol/L的醋酸溶液和醋酸鈉溶液，再將兩者混合至pH 5.0。

0.1 g/100 mL D-半乳糖醛酸溶液、0.5 g/100 mL多聚半乳糖醛酸溶液、PG稀釋液（原酶液稀釋4 000 倍）均用上述醋酸-醋酸鈉緩沖液配制。

1.3.2 酶活力測定

參考周立等[23]的方法，并略作修改。

樣品測定：將0.02 mL PG和0.3 mL 0.5 g/100 mL多聚半乳糖醛酸、0.68 mL醋酸緩沖液（pH 5.0）混合后，在50 ℃下反應30 min，然后加入1 mL DNS試劑，在100 ℃下煮沸5 min，冷卻至室溫，再加入8 mL蒸餾水稀釋，用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度。PG活力為每分鐘水解D-半乳糖醛酸的質量，單位為mg/min。

D-半乳糖醛酸標準曲線的制作：配制質量濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL的D-半乳糖醛酸溶液，將1 mL不同質量濃度的D-半乳糖醛酸溶液與1 mL DNS溶液混合后，100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫，再加入8 mL蒸餾水稀釋。用分光光度計測定540 nm波長處的吸光度，制作標準曲線，得標準曲線方程為：y＝0.861 4x（R2＝0.992 5）。

1.3.3 PG酶液處理

熱處理：取10 mL酶液于100 mL燒杯中，置于水浴鍋中保溫，當酶液中心溫度達到指定溫度后開始計時，達到處理時間后取出。水浴溫度分別為35、45、55、65 ℃，水浴時間分別為0.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 min。

超聲波處理：取50 mL酶液于100 mL燒杯中，超聲功率密度分別為242、605 W/cm2和968 W/cm2。脈沖間隔為2 s開2 s關，超聲頻率為20 kHz，探頭（直徑10 mm）浸入液面深度為2 cm，并采用冰浴，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min。

熱與超聲波同時處理：固定水浴溫度為35 ℃，超聲功率密度分別為242、605 W/cm2和968 W/cm2，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min，其余參數同上；固定超聲功率密度為605 W/cm2，水浴溫度分別采用25、35、45 ℃，超聲波處理時間分別為2、4、6、8、10、12、14 min，其余參數同上。

熱與超聲波先后處理：第1組取50 mL酶液于100 mL燒杯中，在35 ℃的水浴鍋中保溫5 min，當酶液中心溫度達到35 ℃開始計時，然后在冰浴條件下進行超聲波處理，超聲功率密度為605 W/cm2，超聲時間分別為2、4、6、8、10 min；第2組取50 mL酶液于100 mL燒杯中，先在冰浴條件下進行超聲波處理，超聲功率密度為605 W/cm2，超聲時間為5 min，再取10 mL超聲處理后的酶液于100 mL燒杯中，在35 ℃的水浴鍋中保溫2、4、6、8、10 min。

1.3.4 PG活力鈍化動力學分析

酶活力鈍化一般符合一級動力學模型（式（1））。

式中：A為處理t min后的酶活力/（mg/min）；A0為對照組酶活力/（mg/min）；k為設定溫度下的反應速率常數/min－1。

部分轉化模型是一級動力學模型的特例，應用于存在穩(wěn)定和不穩(wěn)定形式的物質，隨著處理時間的延長，穩(wěn)定形式仍然不變的鈍化過程。其模型公式如式（2）所示。

式中：A∞為延長處理時間后的酶活力/（mg/min）。

均方誤差（mean square error，MSE）計算如式（3）所示。

式中：y為預測值；y1為實際值；n為觀測個數；p為參數個數。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復兩次，使用Origin 8.5軟件進行統計并繪圖，數據采用SPSS 17.0軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 溫度對PG活力的影響

圖 1 溫度對PG活力的影響Fig. 1 Effect of heat treatment temperature on PG activity

圖1為溫度對PG的鈍化效果，并用動力學模型擬合。PG對熱敏感，處理5 min時酶活力迅速下降，但在35 ℃下處理30 min仍有82.91%的殘留酶活力。而隨著溫度升高，PG的鈍化效果逐漸增強。55 ℃和65 ℃下處理30 min，PG殘留活力分別為18.54%、5.01%。在4 個溫度下，隨著處理時間從15 min延長至30 min，酶活力未發(fā)生顯著性變化。

部分轉化模型能夠較好擬合溫度對PG的鈍化效果（R2＞0.96，MSE＜5.0）。通過模型擬合計算得到PG的不可鈍化部分A∞的值分別為82.00%、79.23%、25.36%、5.29%（表1）。說明當溫度大于45 ℃時，溫度對PG活力的影響很大。此外，處理15～30 min酶活力未發(fā)生顯著性變化，該結果表明PG存在兩個形式：不耐熱（PG2）和耐熱（PG1）形式。PG1是由PG2與熱穩(wěn)定糖蛋白β-亞基結構關聯形成的二聚體，具有較強的耐熱性，隨著處理溫度的升高，PG1可不同程度地向PG2轉化[24]。因此，殘留的PG活力可能是由于熱穩(wěn)定PG1的存在，而PG活力隨著處理溫度升高而下降可能是由于PG1轉化成了熱不穩(wěn)定的PG2。高溫雖能更好地鈍化PG，但可能導致果蔬汁中的營養(yǎng)成分流失。由于在35 ℃條件下酶活力變化不大，因此選擇35 ℃與超聲波結合作進一步研究。

表 1 熱和超聲波對PG鈍化動力學參數Table 1 Estimation of inactivation kinetic parameters of PG under heat and ultrasonic treatment conditions

2.2 冰浴條件下不同超聲功率密度對PG活力的影響

圖 2 冰浴條件下不同超聲功率密度對PG活力的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on PG activity under ice bath condition

如圖2所示，冰浴條件下，3 種超聲功率密度下，隨著處理時間延長，PG活力均呈下降的趨勢。在242 W/cm2和605 W/cm2超聲功率密度下處理PG稀釋液，對其活力影響不大，處理30 min后殘留酶活力分別為93.25%、95.49%。隨著處理功率密度提高到968 W/cm2，PG活力顯著下降，但968 W/cm2處理12 min后殘留酶活力仍有83.54%。單獨超聲波鈍化PG遵循部分轉化模型公式（R2＞0.90，MSE＜0.1），求得PG的不可鈍化部分A∞的值在78%～96%之間（表1）。

超聲波對酶的鈍化作用主要歸因于空化效應，是指液體中的微小氣泡（氣泡或氣穴）在聲場的作用下被激活，表現為這些氣泡（空化核）的振蕩、生長、收縮及崩潰等一系列動力學過程[25]。氣泡收縮及崩潰瞬間，呈現出局部高溫（＞5 000 K）和高壓（50 MPa），因而導致酶失活[26]。超聲功率密度的增加也增強了空化效應，但可能由于冰浴條件抑制了這一情況的發(fā)生，因而鈍化效果不明顯。由圖2可知，605 W/cm2條件下酶活力變化最小，因此選擇605 W/cm2功率密度做進一步的研究。

2.3 熱與超聲波同時處理對PG活力的影響

2.3.1 35 ℃下不同超聲功率密度對PG活力的影響

圖 3 35 ℃下不同超聲功率密度對PG活力的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic power on PG activity at 35 ℃

圖3為35 ℃下不同超聲功率密度對PG的鈍化效果，隨著處理時間延長，PG殘留活力逐漸下降，超聲功率密度由242 W/cm2增加到605 W/cm2，PG活力發(fā)生顯著性下降（P＜0.05），但從605 W/cm2上升至968 W/cm2時，PG活力差異不顯著（P＞0.05）。242、605、968 W/cm23 種功率密度處理PG稀釋液16 min，PG活力分別下降了29.56%、86.28%、93.10%。一級動力學模型能夠較好擬合此條件下對PG的鈍化效果（R2＞0.94，MSE＜8.3），但242 W/cm2處理PG的鈍化曲線則符合部分轉化模型（R2＝0.972，MSE＝0.38）。相對冰浴條件下的超聲波處理，與35 ℃水浴結合明顯增強了超聲波對PG的鈍化效果，表明兩者結合處理對PG的鈍化有協同作用。超聲波產生的空化效應使酶的二級、三級結構發(fā)生改變，從而導致酶失活[27-28]。王文宗等[14]也研究表明，超聲波產生的能量可能導致維持酶分子二級結構的氫鍵斷裂，導致構象變化，從而抑制酶促反應。溫度的結合可能促進了這一作用，但具體的作用機制還需要進一步進行研究探索。另外，考慮到實際生產成本以及儀器使用壽命，可選用605 W/cm2功率密度結合熱處理。

2.3.2 605 W/cm2的超聲功率密度下不同溫度對PG活力的影響

不同溫度結合605 W/cm2的超聲波處理對PG的鈍化效果如圖4所示?？梢钥闯?，隨著時間延長，PG殘留活力顯著下降（P＜0.05），處理16 min后殘留活力均在30%以下。并且隨著溫度升高，鈍化效果逐漸增強。相比單獨的熱處理，與超聲波結合可以觀察到兩種形式的PG均發(fā)生失活，表明兩者結合使用顯著增強了對PG的鈍化效果。

圖 4 605 W/cm2的超聲功率密度下不同溫度對PG活力的影響Fig. 4 Effect of treatment temperature on PG activity with ultrasonic treatment at 605 W/cm2 powder density

此條件下的鈍化曲線可用一級動力學進行擬合（R2＞0.91，MSE＜6.7）。動力學參數如表1所示，隨著溫度升高，鈍化速率常數k從0.05 min-1增加到0.15 min-1，鈍化效果逐漸增強。前人也報道過熱與超聲波結合對PG的鈍化效果。Terefe等[29]研究顯示，在20 kHz，60～75 ℃，80%能量條件下，蕃茄汁PG的失活率增加了2.3～4.0倍。Vercet等[30]發(fā)現20 kHz、振幅117 μm、200 kPa、70 ℃處理1 min使PG的活力降低62%。這種現象可以歸因于熱與超聲波的協同效應，在實驗條件下，單獨的熱或超聲處理只導致PG2失活。而在加熱過程中，超聲處理可能導致PG1分解成不穩(wěn)定的PG2和熱穩(wěn)定的β-亞基，隨后通過加熱和超聲處理的協同作用使PG2失活[29,31]。

2.4 熱與超聲波先后處理對PG活力的影響

熱與超聲波結合處理顯著增強了對PG的鈍化效果，因此，為進一步研究熱與超聲波兩者之間對PG鈍化的相互關系，本實驗研究了先熱處理再超聲波處理及先超聲波處理再熱處理對PG活力的影響。圖5a為35 ℃水浴5 min后用605 W/cm2冰浴超聲處理對PG活力影響，圖5b為605 W/cm2冰浴超聲5 min后35 ℃水浴處理對PG活力的影響。兩組處理對PG活力影響不大，其殘留活力均在85%以上。在本研究中，35 ℃水浴和605 W/cm2超聲波單獨處理分別造成18.00%、3.90%的PG失活，兩者同時處理能鈍化70%～90%的PG，并且隨著時間延長能使其完全鈍化，而兩者先后處理只能使PG活力降低15%左右。說明熱與超聲波先后處理只能表現出兩者中對PG最大的鈍化效果，僅使PG2失活。因此，只有在熱與超聲波同時作用的前提下，才能表現出兩者的協同效應，使PG1轉化成PG2與β-亞基，從而達到更好的鈍化效果。

圖 5 熱與超聲波先后處理對PG活力的影響Fig. 5 Effect of combination sequence of heat and ultrasonic treatment on PG activity

3 結 論

實驗結果表明，單獨的熱（≤45 ℃）或超聲波處理對PG鈍化效果不明顯，其殘留活力均在80%以上。而兩者同時處理PG酶液，表現出顯著的協同效應，能更好鈍化PG。在20 kHz、35 ℃、605 W/cm2功率密度條件下處理16 min可使酶活力降至13.72%。通過熱與超聲波先后處理酶液的實驗結果得出，只有在兩者同時作用的前提下，才能表現出協同效應，達到更好的鈍化效果。以上實驗結果不僅為超聲波鈍化PG提供了理論數據，也為果蔬汁加工提供了參考。