鐘希 ，鐘橋石 ，程楓 ，丁慧 ，杭亞平

(1、萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 萍鄉(xiāng)337000；2、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；3、江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

肺炎克雷伯菌為院內(nèi)感染常見重要致病菌， 對(duì)臨床常用抗菌藥物多呈高度耐藥，多重耐藥和廣泛耐藥菌株檢出率近年來有所上升[1]。臨床亟需一種能克服現(xiàn)有耐藥機(jī)制的全新藥物。替加環(huán)素是用于臨床的新型甘氨酰四環(huán)素類廣譜抗生素，能有效抑制碳青霉烯酶類耐藥細(xì)菌引起的感染[2]。然而，近幾年替加環(huán)素的耐藥株不斷出現(xiàn)[1，3-5]，使得替加環(huán)素的耐藥問題也越來越受到關(guān)注，但研究主要集中于鮑曼不動(dòng)桿菌。有關(guān)肺炎克雷伯菌替加環(huán)素耐藥情況國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。與此同時(shí)，我國(guó)采用的美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)并未推薦適合臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的檢測(cè)替加環(huán)素敏感性的方法。然而，臨床需要依據(jù)體外藥敏試驗(yàn)來確定用藥方案。因此，我們探討肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素藥敏試驗(yàn)的常用檢測(cè)方法及其耐藥情況，以期為臨床合理應(yīng)用替加環(huán)素提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 從2016年1月17日至2016年4月15日南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床分離的108株肺炎克雷伯菌中，收集非重復(fù)的替加環(huán)素不敏感的肺炎克雷伯菌共34株。

1.1.2 儀器與試劑 VITEK2-Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀及配套鑒定卡和藥敏卡，法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；水解酪蛋白(MH)瓊脂購于Oxoid公司；替加環(huán)素的E-test條 (0.016-256ug/ml)，瑞典AB Biomerieux公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 經(jīng)VITEK2-Compact對(duì)所有菌株進(jìn)行鑒定及藥敏檢測(cè)，篩選出替加環(huán)素不敏感菌株，再進(jìn)行E-test條檢測(cè)，操作步驟同K-B藥敏紙片法。質(zhì)控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603、霍氏腸桿菌ATCC700323和金黃色葡萄球菌ATCC29213對(duì)MH培養(yǎng)基及E-test條進(jìn)行質(zhì)控。藥敏結(jié)果參照美國(guó)食品藥品監(jiān)督局(FDA)判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀，即MIC≤2ug/ml為敏感(S)、4ug/ml為中介(I)、≥8ug/ml為耐藥(R)。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)比較相同判讀標(biāo)準(zhǔn)的兩種方法得到的敏感、中介及耐藥率。

2 結(jié)果

2.1 替加環(huán)素不敏感菌株對(duì)14種常見抗菌藥物的耐藥特性 分析顯示，16株肺炎克雷伯菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥性嚴(yán)重，其中對(duì)環(huán)丙沙星和左旋氧氟沙星耐藥率100%；對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉、頭孢吡肟、頭孢西丁、慶大霉素、亞胺培南、磺胺甲基異噁唑、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉維酸和氨曲南耐藥率高達(dá)80%以上；對(duì)阿米卡星和妥布霉素耐藥率大于65%，詳見表1。

2.2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致性比較 據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)分類一致性(CA)定義為被評(píng)估方法與E-test法藥敏結(jié)果判斷為一致的菌株百分比。VITEK2法與E-test法藥敏結(jié)果判讀為一致的菌株百分比為17.6%(6株)，不敏感判讀一致性的菌株百分比為47.1%（16株）兩種方法的藥敏結(jié)果一致性偏低。

2.3 兩種方法測(cè)定不同菌株對(duì)替加環(huán)素的藥敏結(jié)果 34株肺炎克雷伯菌經(jīng)VITEK2法檢測(cè)，得到18株耐藥株(61.8%)，經(jīng)E-test法確認(rèn)后，顯示7株敏感、10株中介、1株耐藥。而 16株中介株(38.2%)，經(jīng)E-test法確認(rèn)后，顯示 11株敏感、5株中介。兩種檢測(cè)方法對(duì)替加環(huán)素藥敏結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，χ2值 36.33)，詳見表 2。

2.4 E-test法確認(rèn)后替加環(huán)素不敏感菌株的產(chǎn)酶特性 產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌與非產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性結(jié)果顯示，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P＜0.01，χ2值 8.54)，ESBLs+肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥性比ESBLs-肺炎克雷伯菌更嚴(yán)重。碳青霉烯類不敏感肺炎克雷伯菌(CRKP)和敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)對(duì)替加環(huán)素的敏感性比較得到存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異 (P＜0.01，χ2值9.62)，后者對(duì)替加環(huán)素耐藥更嚴(yán)重，詳見表3。

表2 兩種檢測(cè)方法對(duì)替加環(huán)素耐藥率的檢測(cè)結(jié)果比較（%）

表3 不同產(chǎn)酶情況下肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥率及其耐藥率的比較（%）

3 討論

替加環(huán)素抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，無論對(duì)G+菌還是對(duì)G-菌以及需氧菌和厭氧菌均有非常強(qiáng)的抗菌活性。作為首個(gè)被批準(zhǔn)用于臨床的靜脈內(nèi)給藥的甘氨酰環(huán)素類抗生素，替加環(huán)素主要是通過限制細(xì)菌對(duì)藥物的外排作用和核糖體保護(hù)這兩種耐藥機(jī)制產(chǎn)生超強(qiáng)的抗菌活性效應(yīng)，為多重耐藥菌甚至“超級(jí)細(xì)菌”的抗感染治療提供了新手段。近年來，多重耐藥菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥也越來越嚴(yán)重。在美國(guó)，多重耐藥肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為9.2%(MIC28mg/L，F(xiàn)DA[6])，而在西班牙產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌的替加環(huán)素耐藥率為33.3%(MIC＞2mg/L，EUCAST[7])。 顯然與碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的日益增多和替加環(huán)素使用的增加[8]密切相關(guān)。我院在2015年之前還未見肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素耐藥情況的報(bào)道[9]，肺炎克雷伯菌短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)較多對(duì)替加環(huán)素不敏感菌株，應(yīng)引起感染控制部門的高度重視，是否存在同源性菌株播散，有待進(jìn)一步研究。

有研究報(bào)道，AcrAB外排泵基因的高表達(dá)可同時(shí)引起腸桿菌科細(xì)菌對(duì)替加環(huán)素、四環(huán)素和喹諾酮類抗生素MIC值的升高[2]。此外，越來越多的證據(jù)表明耐藥株可以通過質(zhì)粒介導(dǎo)的外排泵基因使得耐藥基因在不同種屬菌株之間進(jìn)行水平傳播[10]。因此，替加環(huán)素耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，可能與外排泵基因密切相關(guān)。表1顯示出我們篩選的16株替加環(huán)素不敏感肺炎克雷伯菌耐藥性普遍嚴(yán)重，很難為臨床用藥提供經(jīng)驗(yàn)參考，同時(shí)表明細(xì)菌共同攜帶的耐藥表型和耐藥機(jī)制日趨多樣化、復(fù)雜化。外膜蛋白缺失僅僅使碳青霉烯類藥物的MIC升高并不能達(dá)到耐藥折點(diǎn)，合并產(chǎn)ESBLs可產(chǎn)生高水平耐藥，因此ESBLs高產(chǎn)率菌株會(huì)導(dǎo)致更多的對(duì)碳青霉烯類藥物耐藥[11]。本研究結(jié)果顯示ESBLs+肺炎克雷伯菌和CSKP對(duì)替加環(huán)素的耐藥性更嚴(yán)重，可推測(cè)ESBLs+菌株會(huì)表現(xiàn)出對(duì)替加環(huán)素的交叉耐藥，也支持了替加環(huán)素可用于治療CRKP感染的可行性。

臨床上檢測(cè)替加環(huán)素的體外活性的方法很多，但常常因各種客觀條件而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性[12]。現(xiàn)在臨床上檢測(cè)替加環(huán)素的體外活性的方法以微量肉湯稀釋法（BMD）為參考標(biāo)準(zhǔn)；在鮑曼不動(dòng)桿菌中，經(jīng)E-test法和BMD獲得的替加環(huán)素MIC結(jié)果可能不一致[13]；在肺炎克雷伯菌中，兩種方法檢測(cè)的替加環(huán)素MIC結(jié)果一致性較好。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明VITEK2法檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率假性偏高，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道一致[13]。因此，進(jìn)一步證實(shí)VITEK2法不能作為檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)替加環(huán)素敏感性的常規(guī)方法，尤其是對(duì)于產(chǎn)ESBLs肺炎克雷伯菌和碳青霉烯類敏感肺炎克雷伯菌，宜采用E-test法對(duì)替加環(huán)素不敏感菌株進(jìn)行復(fù)核，避免誤差，為臨床合理用藥提供可靠的依據(jù)。