鄒 靜，孟 軍，張建才，葛男，李 斌

（河北科技師范學院食品科技學院，河北昌黎 066600）

目前，工業(yè)用醋酸菌主要來源于醋桿菌屬（Acetobacter）、葡糖桿菌屬（Gluconobacter） 和葡糖醋桿菌屬（Gluconoacetobacter） 3個菌屬[1-2]。醋酸菌在實際生產(chǎn)過程中會面臨多種脅迫因素，如發(fā)酵初期來自乙醇的高濃度脅迫、發(fā)酵后期醋酸自身的脅迫和夏季高溫的脅迫等。這些脅迫會抑制醋酸菌的生長、代謝及生理功能，而醋酸菌應對脅迫環(huán)境的應答機制是提高醋酸菌生產(chǎn)能力的關(guān)鍵，也是目前醋酸菌的研究熱點之一。

研究表明，醋酸菌的耐脅迫應答分子機制主要包括以下3個方面：①由多種脫氫酶參與的乙醇氧化機制。這些酶主要包括乙醛脫氫酶（由ALDH基因編碼）、乙醇脫氫酶（由ADH基因編碼）[3-4]。P Chinnawirotpisan等人[5]經(jīng)過誘變得到1株ADH活性缺失菌株，與親本相比，該菌株無法利用乙醇生產(chǎn)醋酸，同時醋酸耐受性缺失。②由乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶AarC參與的醋酸過氧化機制。通過該酶的作用，乙酸被氧化并最終通過乙醛酸代謝途徑完成轉(zhuǎn)變[6]。③乙酸泵出機制。該泵出機制是通過與ATP結(jié)合的轉(zhuǎn)運蛋白ABC（ATP-binding cassette） 來實現(xiàn)的，而ABC轉(zhuǎn)運機制是一種耗能的主動轉(zhuǎn)運機制[7]。④通用抗逆機制包括抗逆蛋白及分子伴侶（GrpE，DnaJ，DnaK）[8]。除此之外，有報道稱巴氏醋桿菌（A.pasteurianus）細胞膜的流動性與乙酸抗性有關(guān)，隨著乙酸體積分數(shù)的升高，細胞膜的流動性增加[9]。有些巴氏醋桿菌巴氏醋桿菌還會通過改變莢膜多糖的含量來應對可逆環(huán)境。但是，上述這些報道都是獨立的，而巴氏醋桿菌的耐性機理應是一個有機整體，因此在面對脅迫條件時，其生理變化也是其抗脅迫環(huán)境的方法之一。

微生物可以通過改變生理狀態(tài)來應對逆性環(huán)境。Kanchanarach W等人[10]報道稱細胞膜多糖形成能力可以直接體現(xiàn)巴氏醋桿菌耐性能力，而酵母菌會通過改變細胞膜流動性[11]、調(diào)整細胞膜脂肪酸的組成等手段來應對逆性環(huán)境[12]。以實驗室保藏的生產(chǎn)用巴氏醋桿菌為出發(fā)菌株，通過改變脅迫條件，確定巴氏醋桿菌在應對脅迫環(huán)境時的生理變化。然后在含有2%乙醇條件下，添加不同外源脂肪酸，確定逆性條件下不同脂肪酸對巴氏醋桿菌的保護能力。

1 材料與方法

1.1 試驗所用微生物

巴氏醋桿菌（A.pasteurianus） 7015，實驗室保藏菌種。

1.2 試驗所用的培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH值，于121℃條件下滅菌20 min。

1.2.2 不同脅迫條件培養(yǎng)基

不同脅迫物質(zhì)，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO41 g/L，自然pH值，于121℃條件下滅菌20 min。

培養(yǎng)基中脅迫成分和脅迫體積分數(shù)見表1。

表1 培養(yǎng)基中脅迫成分和脅迫體積分數(shù)

1.2.3 不同脂肪酸培養(yǎng)基

酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，MgSO41 g/L，外源脂肪酸0.2 g/L（分別為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸），自然pH值，于121℃條件下滅菌20 min后，加入終體積分數(shù)為2%（V/V）的無水乙醇，對照為未加脅迫物質(zhì)的培養(yǎng)基。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞多糖的測定

采用苯酚-硫酸法測定細胞多糖含量[13]。用50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH值5.8） 洗滌菌體2次后得到菌體細胞懸液。將50 mL濃硫酸緩緩加入10 mL去離子水中，冷卻至室溫后加入0.6 g苯酚晶體，攪拌溶解配成顯色液。取1.00 mL菌懸液于試管中，加入5.00 mL顯色液振蕩均勻，置于沸水浴中保溫30 min后轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻至室溫，取出于波長490 nm處測定其OD值。每個樣品平行測定3次。

1.3.2 細胞膜流動性測定

細胞膜側(cè)向擴散速率和微黏度的測定按照李寶坤等人的方法[14]，利用熒光偏振法測定細胞膜流動性。熒光偏振（P） 和細胞的平均微黏度（η） 的計算公式如下：

式中：IVV和IVH——激發(fā)光為垂直方向的偏振光，而發(fā)射光分別為垂直和水平方向的偏振光時測得的熒光強度；

G——光柵矯正因子（G=IHV/IHH）；

IHV和IHH——激發(fā)光為水平方向的偏振光，而發(fā)射光分別為垂直和水平方向的偏振光時測得的熒光強度。

P和η值越大表明細胞膜流動性越小。

1.3.3 細胞內(nèi)膜透性的測定

細胞內(nèi)膜透性的測定參照吳重德等人[15]的方法。離心（6 000×g，10 min，4℃）收獲不同體積分數(shù)乙醇脅迫條件下對數(shù)生長末期的菌體，用10 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH值7.0）離心洗滌2次后重懸于相同緩沖溶液中并調(diào)節(jié)菌體濃度為OD600=1.0，取1 mL菌懸液添加ONPG至終質(zhì)量濃度為100 μg/mL，保持70 min后用分光光度計測定于波長420 nm處的吸光度。

1.3.4 H+-ATPase活性的測定

質(zhì)膜的制備參照李中超[16]的方法。醋酸菌培養(yǎng)到對數(shù)中后期時，取100 mL菌懸液離心（10 000×g，10 min，），用0.9%NaCl溶液沖洗2次，去除雜質(zhì)，將菌體重懸于2 mL的NaCl溶液中，轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，離心（10 000×g，5 min，4℃） 1次，用移液槍沖洗除盡上層雜質(zhì)，再次重懸于0.9%的NaCl溶液中，離心（12 000×g，2 min，4℃） 得到干凈菌體。將離心收獲的菌體，懸浮于Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L Tris， 10 mmol/L MgCl2， 0.05%Triton X-100，pH值7.0） 中，得到OD600=2.0的菌懸液。將其置于-20℃條件下冷凍24 h，在測定質(zhì)膜H+-ATPase活性之前，將凍結(jié)的樣品于30℃條件下快速解凍。

H+-ATPase活性測定參照亓正良等人[17]的方法。0.1 mLATP（30 mmol/L） +0.4 mL反應液（3.75 mmol/L MgCl2，100 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L TIis-HCl，pH值7.2） 置于試管中，于30℃條件下保溫5 min，加入透性細胞懸浮液0.5 mL，再保溫30 min，加入0.2mL三氯乙酸（20%，W/V）終止反應，6 000×g離心10 min，取上清液0.5 mL加入2.5 mL硫酸亞鐵-鉬酸銨試劑。反應10 min，顏色變藍后，于波長660 nm處測定吸光度。根據(jù)標準曲線求出Pi的含量。酶的活性單位為μmol（Pi）/g（protein）·min。

蛋白濃度的測定采用考馬斯亮藍法，用蛋白濃度定量試劑盒測定，以牛血清蛋白為標準蛋白。1.3.5 胞內(nèi)ATP含量的測定

采用TCA法提取細胞中的ATP。將0.5 mL菌液與等體積預冷的0.03 g/mL的TCA混合，振搖3 min后加入20 mL的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（pH值7.4）加以稀釋，以終止其反應。

胞內(nèi)ATP含量采用ATP含量試劑盒進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 脅迫條件對巴氏醋桿菌生理特性的影響

2.1.1 不同脅迫條件對細胞多糖含量的影響

有關(guān)細胞多糖與醋酸菌耐受性之間的關(guān)系目前有2種截然不同的觀點。Kanchanarach W等人[10]研究發(fā)現(xiàn)巴氏醋桿菌在醋酸發(fā)酵后期和醋酸過氧化階段，細胞多糖的含量逐漸增加，因此認為細胞多糖含量與細胞耐酸能力相關(guān)。而Andrés-Barrao C等人[18]發(fā)現(xiàn)，隨著醋酸發(fā)酵的進行，巴氏醋桿菌LMG 1262T的多糖含量是逐漸減少的，這將有助于乙醇快速進入胞內(nèi)代謝并將產(chǎn)物快速排出至胞外。而固態(tài)法生產(chǎn)食醋時，進行醋酸發(fā)酵時乙醇的初始體積分數(shù)為4%～5%，發(fā)酵終止時乙酸的體積分數(shù)也為4%～5%，因此通過添加乙醇、乙酸來模擬醋酸菌發(fā)酵前期和后期環(huán)境，并通過改變乙酸和乙醇的體積分數(shù)來確定不同脅迫條件和不同脅迫劑量對該巴氏醋桿菌的影響。

不同脅迫條件對巴氏醋桿菌7015細胞多糖含量的影響見圖1。

從圖1可以看出，在正常條件下該株巴氏醋桿菌莢膜多糖的合成量占細胞干質(zhì)量的31.25%，而在乙醇和乙酸環(huán)境中，該株菌的細胞多糖含量是隨著脅迫物質(zhì)含量的增加而逐漸減少的。與相同體積分數(shù)的乙醇相比，該株巴氏醋桿菌在應對乙酸逆性條件時，細胞莢膜多糖含量減少幅度更大。例如，當乙醇體積分數(shù)達到5%時，細胞多糖含量為19.85%，而相同體積分數(shù)的乙酸脅迫條件下，細胞多糖僅為1.92%。因此，試驗選用的巴氏醋桿菌7015是通過降低細胞多糖的含量來應對脅迫環(huán)境的，且乙酸對細胞多糖含量影響大于相同體積分數(shù)乙醇的影響。

圖1 不同脅迫條件對巴氏醋桿菌7015細胞多糖含量的影響

2.1.2 不同脅迫條件對細胞膜流動性的影響

除了調(diào)節(jié)莢膜多糖的合成以外，一些極端微生物會通過增加細胞膜的流動性來抵抗不利的生存環(huán)境。試驗以嵌二萘為熒光探針測定其側(cè)向擴散速率，根據(jù)嵌二萘單體和激發(fā)態(tài)二聚體的熒光強度的比值確定細胞膜的流動性。

不同碳源組成對巴氏醋桿菌7015膜流動性的影響見圖2。

圖2 不同碳源組成對巴氏醋桿菌7015膜流動性的影響

從圖2可以看出，在以葡萄糖為碳源的正常條件下，細胞膜的熒光偏振度（P） 和微黏度（η） 的值越小，意味著此時細胞膜流動性越大。從圖2（a）可以看出，隨著乙醇劑量的增加，細胞膜的熒光偏振度和微黏度度逐漸減小，這就意味著細胞膜的流動性是逐漸增大的。在以乙酸為唯一碳源的培養(yǎng)基中，如圖2（b），巴氏醋桿菌的細胞膜流動性也是隨著乙酸體積分數(shù)的增加而增大。而且，相同體積分數(shù)條件下乙酸對細胞膜流動性的影響要略大于乙醇的影響。因此，巴氏醋桿菌7015除了通過減少莢膜多糖含量來應對不良環(huán)境外，也會通過增加細胞膜的流動性來應對脅迫環(huán)境。

2.1.3 不同脅迫物質(zhì)對細胞膜透性的影響

ONPG是β-半乳糖苷酶的底物，當細胞內(nèi)膜不完整時ONPG會很快進入細胞內(nèi)，并被細胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶所降解，降解產(chǎn)物呈現(xiàn)黃色并在420 nm波長下具有最大吸收峰，因此可以用吸光度的大小來評價細胞膜透性的程度。

不同碳源組成對巴氏醋桿菌7015細胞膜透性的影響見圖3。

圖3 不同碳源組成對巴氏醋桿菌7015細胞膜透性的影響

從圖3可看出，乙醇和乙酸對該菌細胞膜透性的影響是截然相反的。在乙醇環(huán)境中，隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增加，細胞的吸光度逐漸增加，表明該株巴氏醋桿菌的細胞膜透性逐漸增加；而在乙酸環(huán)境中，隨著乙酸體積分數(shù)的增加，細胞的吸光度逐漸下降，表明在乙酸環(huán)境中該株巴氏醋桿菌的細胞膜透性是逐漸降低的。對于醋酸生產(chǎn)而言，乙醇是屬于初始的底物，因此醋酸菌會通過增加通透性的方法使底物迅速進入到細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)化，防止其對細胞造成傷害；而乙酸屬于代謝產(chǎn)物，微生物會迅速將其排出胞外，并阻止其再次進入到胞內(nèi)。因此在模擬的乙酸逆性環(huán)境中，該株微生物是采用減弱膜透性的方法抵御代謝產(chǎn)物再次進入到細胞內(nèi)。

2.1.4 不同脅迫物質(zhì)對細胞膜結(jié)合H+-ATPase活性及胞內(nèi)ATP含量的影響

研究表明，H+-ATPase活性與微生物細胞中ATP的代謝密切相關(guān)，其活性高低可反映出微生物在當時所處階段的能量需求。醋酸菌抵御外界不利環(huán)境的響應機制大多需要消耗ATP來維持細胞正常運行，因此推測乙醇的脅迫刺激可能會提高H+-ATPase活性，從而提高能量供應水平。

不同乙醇體積分數(shù)（a） 和乙酸體積分數(shù)（b）對巴氏醋桿菌7015細胞膜H+-ATPase活性及胞內(nèi)ATP濃度的影響見圖4。

圖4 不同乙醇體積分數(shù)（a）和乙酸體積分數(shù)（b）對巴氏醋桿菌7015細胞膜H+-ATPase活性及胞內(nèi)ATP濃度的影響

從圖4可以看出，巴氏醋桿菌7015在面對乙酸、乙醇時，其ATP酶活性增加，而胞內(nèi)ATP濃度卻降低，這表明該株巴氏醋桿菌也是通過大量消耗ATP來應對逆性環(huán)境的，這與Andrés-Barrao C等人[18]的研究相符。在乙醇和乙酸各自的脅迫環(huán)境中，ATP酶活性和胞內(nèi)ATP濃度改變的情況有較大差異。當乙醇體積分數(shù)為2%時，見圖4（a），ATP酶活性為非應激狀態(tài)下的2.36倍。隨著乙醇體積分數(shù)的增加，ATP酶活性逐漸降低，當乙醇體積分數(shù)為5%時，ATPase活性為非應激狀態(tài)下的1.99倍。而伴隨著ATP酶活性增加，胞內(nèi)ATP含量是逐漸下降的，乙醇體積分數(shù)越高，胞內(nèi)ATP含量越低（如乙醇體積分數(shù)為5%時，胞內(nèi)ATP含量為非應激狀態(tài)下ATP含量的66.9%），表明該株巴氏醋桿菌在應對乙醇脅迫時是大量耗能的。而在乙酸環(huán)境中，見圖4（b），隨著乙酸體積分數(shù)的增加，ATP酶活性逐漸增加，而胞內(nèi)ATP濃度卻快速下降。當乙酸體積分數(shù)為5%時，ATP酶活性是非應激狀態(tài)下的2.27倍，而胞內(nèi)ATP濃度卻為非應激狀態(tài)時的9.74%。由此可以看出，該株巴氏醋桿菌在應急狀態(tài)下會消耗ATP產(chǎn)生應激機制，而且不同的脅迫物質(zhì)所消耗的能量是不同的。

2.2 外源脂肪酸對巴氏醋桿菌生理特性的影響

2.2.1 外源脂肪酸對細胞多糖含量的影響

研究表明，脂肪酸可以弱化脅迫環(huán)境對細胞膜的傷害，達到保護細胞內(nèi)容物的作用。在以乙醇為脅迫條件的培養(yǎng)基中分別添加不同脂肪酸來確定脂肪酸對巴氏醋桿菌抗逆性的作用。

不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015細胞多糖含量的影響見圖5。

圖5 不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015細胞多糖含量的影響

從圖5可以看出，在以乙醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中添加外源脂肪酸可以增加細胞莢膜多糖含量，且棕櫚酸、硬脂酸、油酸對增加細胞多糖的效果要優(yōu)于亞油酸，但添加有機酸后細胞多糖的含量還是要低于沒有脅迫條件時的多糖濃度（對照組）。這就表明，外源添加脂肪酸可以減弱乙醇對巴氏醋桿菌的應激作用，且飽和脂肪酸與非飽和脂肪酸都可以促進巴氏醋桿菌合成細胞多糖。

2.2.2 外源脂肪酸對細胞膜流動性的影響

研究表明，不同的脂肪酸類型對菌體耐脅迫能力的影響程度是不同的，且長鏈飽和脂肪酸對細胞膜的保護作用要強于不飽和脂肪酸[19]。棕櫚酸、硬脂酸屬于長鏈飽和脂肪酸，而油酸和亞油酸屬于長鏈不飽和脂肪酸。

不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015膜流動性的影響見圖6。

圖6 不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015膜流動性的影響

從圖6可以看出，與乙醇逆性相比，添加棕櫚酸、硬脂酸后，微黏度和熒光偏振度均增加，表明細胞膜的流動性降低、穩(wěn)定性增強，且棕櫚酸的效果優(yōu)于硬脂酸；而油酸和亞油酸屬于不飽和脂肪酸，它們的添加會進一步使細胞膜的流動性增強，此結(jié)論與前人報道的一致。

2.2.3 外源脂肪酸對細胞膜透性的影響

分別測定了不同脂肪酸對細胞膜透性的影響，分析脂肪酸與細胞膜透性之間的關(guān)系。

外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015內(nèi)膜透性的影響見圖7。

圖7 外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015內(nèi)膜透性的影響

從圖7可以看出，在有脅迫物質(zhì)存在的條件下，添加外源脂肪酸均可以減弱細胞膜的透過性，提高細胞膜的穩(wěn)定性。其中飽和脂肪酸的效果要優(yōu)于不飽和脂肪酸，且飽和度越高對細胞膜透性的影響越大。因此，可以看出飽和脂肪酸在減弱膜透性的同時增強膜的穩(wěn)定性。

2.2.4 外源脂肪酸對膜結(jié)合H+-ATPase活力及胞內(nèi)ATP含量的影響

因為微生物在對抗逆性環(huán)境時，需要消耗大量的能量，因此分別測定了逆性環(huán)境中添加不同脂肪酸時胞內(nèi)對H+-ATPase活力及胞內(nèi)ATP含量的影響。

不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015細胞膜H+-ATPase活性的影響見圖8。

圖8 不同外源脂肪酸對巴氏醋桿菌7015細胞膜H+-ATPase活性的影響

從圖8可以看出，添加外源脂肪酸可以增加H+-ATPase酶活性，而且不飽和脂肪酸對酶活的影響要明顯高于飽和脂肪酸。除硬脂酸外，添加外源脂肪酸可以增加胞內(nèi)ATP濃度。在培養(yǎng)基中添加棕櫚酸，使絮凝酵母質(zhì)膜H+-ATPase活性提高1.6倍，而添加含亞油酸及亞麻酸H+-ATPase活性卻減少。而添加脂肪酸后（除硬脂酸外），細胞內(nèi)ATP含量均較單純的乙醇對照組提高，說明該株巴氏醋桿菌細胞在有外源脂肪酸的情況下，面臨相同的脅迫條件時可以減弱胞內(nèi)ATP的消耗量，因此積累量增加；而添加不飽和脂肪酸也可以減弱胞內(nèi)ATP的消耗含量，其減弱程度高于飽和脂肪酸的減弱程度；而且不飽和度越高，胞內(nèi)ATP積累量越高。

3 結(jié)論

在面對不同脅迫條件時，巴氏醋桿菌會降低細胞莢膜多糖的合成量來增加細胞外運能力。同時巴氏醋桿菌還通過增強細胞膜透性和流動性來應對脅迫物質(zhì)，同時會提高H+-ATPase酶活性來應對高耗能的抗脅迫運動。而外源脂肪酸的添加有助于巴氏醋桿菌應對乙醇的脅迫，首先添加脂肪酸可以提高細胞莢膜多糖的含量；其次添加脂肪酸可以提高細胞膜的穩(wěn)定性（細胞膜流動性、細胞膜透性均降低），同時提高了H+-ATPase活性，使得細胞內(nèi)ATP合成量增加，但是依然弱于以葡萄糖為碳源的環(huán)境。飽和脂肪酸在增加細胞膜穩(wěn)定性方面要高于不飽和脂肪酸，而在提高H+-ATPase活性、增強ATP合成量和細胞膜穩(wěn)定性方面不飽和脂肪酸要優(yōu)于飽和脂肪酸，且不飽和度越高，增強能力越強。