曾 珍 陳文添 戴艷枝

（1.江西省贛州市尋烏縣人民醫(yī)院病理科，江西贛州 342200；2.江西省贛州市尋烏縣人民醫(yī)院內(nèi)1科，江西贛州 342200；3.江西省人民醫(yī)院病理科，江西南昌 330006）

結(jié)直腸癌（CRC）是世界第3大流行性腫瘤，2015年的中國(guó)惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在全部惡性腫瘤中均位居前5位[1]。美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)預(yù)測(cè)，2018年其新發(fā)人數(shù)和死亡人數(shù)在男女性中均居第3[2]。其發(fā)病率在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)逐年上升，除與動(dòng)物蛋白在人們飲食結(jié)構(gòu)中比重的增加，還與抑癌基因以及癌基因的改變密切相關(guān)[3]。在近幾年當(dāng)中，人們對(duì)結(jié)直腸癌與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞凋亡機(jī)制異常之間的相關(guān)性進(jìn)行了進(jìn)一步研究，如：（1）Survivin基因?yàn)榈蛲鲆种频鞍准易逯械囊粋€(gè)新成員，于細(xì)胞分裂周期G2/M 期中呈現(xiàn)出高表達(dá)的情況，具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，通過對(duì)該基因的表達(dá)進(jìn)行有效地抑制，能夠加快腫瘤細(xì)胞凋亡的速度，其基因突變都與結(jié)直腸癌等多種腫瘤有關(guān)。（2）Wnt/β-catenin信號(hào)通路能夠?qū)?xì)胞的分化與增值進(jìn)行調(diào)節(jié)，而β-catenin則是該通路的一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)β-catenin蛋白和survivin蛋白在結(jié)直腸癌的表達(dá)情況并分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，研究這兩種蛋白和結(jié)直腸癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般材料

選取2013年6月至 2017 年6月本院病理科保存的60例結(jié)直腸癌病理組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，患者術(shù)前未進(jìn)行抗腫瘤治療，有完整的臨床資料。男性36例、女性24 例；年齡 32 ～ 86歲，平均年齡62歲；腫瘤直徑＞5 cm的32例，直徑＜5 cm的28例；高分化腺癌12 例，中分化腺癌 34例，低分化腺癌 14例；根據(jù) Dukes分期： A + B 期33例，C + D 期 27 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27 例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例。以同期結(jié)直腸腺瘤手術(shù)存檔的蠟塊以及癌旁超過5 cm的正常結(jié)直腸組織病理蠟塊各40例為對(duì)照組。

1.2 方法

標(biāo)本固定利用10%中性福爾馬林，經(jīng)石蠟包埋，并予以連續(xù)切片處理，厚度為4μm，然后再予以HE和免疫組化染色處理。本研究所用的試劑主要有：兔抗人 Survivin多克隆抗體（由“福州邁新公司”提供），β-catenin多克隆抗體（由“Abcam公司”提供），SP試劑盒、PBS緩沖液以及枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液及SP試劑盒都由“福州邁新公司”提供。染色時(shí)，嚴(yán)格按照相關(guān)說明書中的內(nèi)容進(jìn)行，并在實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)置陰性和陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 結(jié)果評(píng)價(jià)

在機(jī)體的細(xì)胞膜、細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，β-catenin均可定位，陽(yáng)性細(xì)胞為淡黃-棕黃色的顆粒，若細(xì)胞提示陽(yáng)性，即可判斷為異常表達(dá)。若β-catenin≤50%細(xì)胞核陽(yáng)性，提示低表達(dá)；若β-catenin＞50%細(xì)胞核陽(yáng)性，提示高表達(dá)。

由兩名高資歷且臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師進(jìn)行閱片，于光鏡下對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞為棕褐色細(xì)顆粒狀。在細(xì)胞核亦或者是細(xì)胞質(zhì)中，Survivin 都能定位和表達(dá)。按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，也就是從腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)和染色反應(yīng)強(qiáng)度這兩方面上進(jìn)行判斷。其中，染色強(qiáng)度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：無陽(yáng)性著色-0分，淡黃色-1分，棕黃色-2分，棕褐色-3分。采取隨機(jī)法并利用高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞所占的比例，將之分為5級(jí)，詳細(xì)如下：（1）0分：無陽(yáng)性表達(dá)（或者陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于 5% ）。（2）1分：5 ～ 25 %。（3）2分：26 ～ 50 %。（4）3 分：51 ～ 75 % 。（5）4 分：＞ 75 %。計(jì)算兩項(xiàng)評(píng)分之和，4分提示陽(yáng)性，0分提示陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

β-catenin能夠在細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行定位，陽(yáng)性細(xì)胞為淡黃-棕黃色的顆粒，見表1。細(xì)胞核陽(yáng)在結(jié)直腸癌中的異常表達(dá)。β-catenin 在結(jié)直腸癌中的陽(yáng)性率比結(jié)直腸腺瘤以及癌旁正常結(jié)直腸組織高，P=0。Survivin 蛋白在細(xì)胞質(zhì)已著手細(xì)胞核定位。結(jié)直腸癌的Survivin陽(yáng)性率比結(jié)直腸腺瘤與癌旁正常結(jié)直腸組織高，P=0 。

表1 β-catenin和Survivin在結(jié)直腸癌、結(jié)直腸腺瘤和癌旁正常組織中的陽(yáng)性表達(dá)率[例（%）]

結(jié)直腸癌中β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)直腸癌中β-catenin和Survivin 蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)（ r= 0. 173，P= 0. 027），見表 2 。

表2 結(jié)直腸癌中β-catenin和Survivin表達(dá)的相關(guān)性

β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系。β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌患者性別、年齡和腫瘤大小比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與結(jié)直腸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床Dukes分期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3 。

3 討論與結(jié)論

大量研究[4-6]表明，在消化道惡性腫瘤類疾病中，結(jié)直腸癌具有比較高的發(fā)病率，且可致人死亡，近幾年來，該病的發(fā)病率顯著升高，已經(jīng)對(duì)人類的生命健康造成了較大的威脅。 而凋亡抑制基因表達(dá)于直腸細(xì)胞中亦或者是抑癌基因突變則是引發(fā)直腸癌的重要原因[7]。

Wnt信號(hào)通路能夠?qū)?xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及運(yùn)動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，且其也參加了胚胎到成體的胚胎早期的發(fā)育過程，能夠?qū)?xì)胞的分化、增殖、凋亡與生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)控。作為生物進(jìn)化期間比較保守的一條通路，在正常且成熟的細(xì)胞當(dāng)中，Wnt信號(hào)通路處于關(guān)閉狀態(tài)。其在胚胎細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用[8]。Wnt包含有多條信號(hào)通路，其中比較常見的有經(jīng)典Wnt信號(hào)通路，也就是Wnt/β-catenin信號(hào)通路。其中，β-catenin 是通路中比較重要的一個(gè)信號(hào)傳遞子，同時(shí)也是一個(gè)樞紐因子。而β-catenin 蛋白則能起到抑制癌細(xì)胞侵襲以及激活通路的作用。在正常細(xì)胞當(dāng)中，β- catenin 蛋白以及細(xì)胞膜上的軸蛋白和鈣黏蛋白會(huì)相互結(jié)合，并形成一種降解復(fù)合物，使得細(xì)胞質(zhì)中的β- catenin 蛋白較低[9]。Wnt異常激活后，會(huì)對(duì)β-catenin 蛋白的降解進(jìn)行抑制，使得β-catenin 蛋白大量進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核中，與TCF/LEF相結(jié)合并形成復(fù)合體，同時(shí)對(duì)通路下游的靶基因進(jìn)行激活，使得細(xì)胞發(fā)生了異常增殖的情況，進(jìn)而加快了腫瘤形成的速度[10]。相關(guān)資料中提及，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常和多種腫瘤疾病密切相關(guān)，如胃癌、肝癌等[11-12]。此外，也有報(bào)道稱[13-17]，在胰腺癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌以及卵巢癌等惡性腫瘤當(dāng)中，Survivin 都呈現(xiàn)出了高表達(dá)的情況。

表3 β-catenin蛋白和Survivin蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理因素的關(guān)系

近幾年來，人們通過研究發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)凋亡抑制蛋白家族成員，也就是Survivin，為凋亡抑制劑，能夠起到促細(xì)胞增殖以及抑制細(xì)胞凋亡的作用，通過對(duì)該基因進(jìn)行有效地抑制，能夠加快腫瘤細(xì)胞凋亡的速度。本研究顯示，在結(jié)直腸癌中β-catenin與Survivin的表達(dá)比結(jié)直腸腺瘤以及癌旁正常組織高（P＜0.05）。β-Catenin、Survivin 表達(dá)與腫瘤大小、性別以及年齡無任何相關(guān)性（P＞0.05），但與結(jié)直腸癌的 Dukes分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)中，β-catenin細(xì)胞核高表達(dá)與多種因素密切相關(guān)，包括結(jié)直腸癌組織的Dukes分期、分化程度與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）。表明 β-catenin細(xì)胞核的表達(dá)量是診斷結(jié)直腸癌和判斷患者預(yù)后的一種重要指標(biāo)[18]，主要可能為，β-catenin細(xì)胞核的表達(dá)和細(xì)胞增殖、襲轉(zhuǎn)移與凋亡基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)密切相關(guān)。另外，本組實(shí)驗(yàn)中，Survivin 在結(jié)直腸癌、腺瘤及正常組織中的表達(dá)是逐漸降低的，本研究結(jié)果與 Adamkov等[19]的研究一致。對(duì)于結(jié)直腸癌患者來說，腫瘤惡性程度的加重以及病情的進(jìn)展，能夠增加Survivin 的表達(dá)，提示 Survivin 的表達(dá)能夠反映出結(jié)直腸癌的發(fā)生與進(jìn)展，因此，Survivin具有非常高的應(yīng)用價(jià)值，有助于臨床醫(yī)師診斷結(jié)直腸癌。

在結(jié)直腸癌的發(fā)病和進(jìn)展中，β-catenin蛋白和Survivin蛋白高表達(dá)起著至關(guān)重要的作用。部分結(jié)直腸癌是從腺瘤發(fā)展而來的，聯(lián)合檢測(cè)β-catenin蛋白和Survivin蛋白有助于了解結(jié)直腸腫瘤的生物學(xué)行為并對(duì)患者的早期診斷、判斷預(yù)后提供分子生物學(xué)的支持，有望成為結(jié)直腸癌的基因分型及基因治療的新靶點(diǎn)。