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        醬油中生物胺的形成機(jī)制及其測定

        2018-10-22 12:01:38王青華范桂強(qiáng)張咚咚
        中國調(diào)味品 2018年10期
        關(guān)鍵詞:酪胺酰氯組胺

        王青華,范桂強(qiáng),張咚咚

        (1.天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津 300457;2.衡水市食品藥品檢驗檢測中心,河北 衡水 053000)

        生物胺是一類含氨基的低分子質(zhì)量且具有一定生物活性的有機(jī)化合物的總稱,廣泛存在于多種食品中,尤其是魚類及其相關(guān)產(chǎn)品,酒類、肉類、干酪、豆制品及其他發(fā)酵制品中。組胺、酪胺、腐胺、尸胺、精胺、苯乙胺和色胺被認(rèn)為是食物中最普遍的生物胺[1]。

        食品中的生物胺由于其潛在的生理和毒性作用對人類健康產(chǎn)生了極大危害。如果攝入過量的生物胺會引起一系列的健康問題,會出現(xiàn)如頭痛、惡心、血壓不穩(wěn)、心悸等癥狀,在各類生物胺中,普遍認(rèn)為對人類健康危害最大的是組胺和酪胺[2,3]。

        1 醬油中生物胺的形成

        1.1 生物胺的生理作用

        組胺在哺乳動物的腦部組織中,在充當(dāng)過敏癥[4]、胃酸分泌[5,6]、神經(jīng)傳遞介質(zhì)化學(xué)調(diào)節(jié)劑方面起到很大的作用[7,8]。當(dāng)食品中組胺含量較低時,該食品不會被認(rèn)為存在健康風(fēng)險;在體內(nèi),長期缺乏組胺和組胺過量都會引起神經(jīng)和生理方面的功能失調(diào)。但當(dāng)攝入量超過1000 mg/kg時,會直接導(dǎo)致食物中毒如干酪綜合癥等[9,10],嚴(yán)重的會引起明顯的生理和毒性危害。組胺含量異常會出現(xiàn)明顯的功能失調(diào)癥狀如胃疾病、肥大細(xì)胞癥、骨髓性白血病等[11]。

        酪胺,又名p-對羥基苯乙胺,據(jù)報道,攝入大量含酪胺的食品后會引起明顯的毒性作用[12]。還有文獻(xiàn)說明患有偏頭痛的病人攝入含有酪胺的食品后會加重偏頭痛的病情[13,14]。酪胺還會加速神經(jīng)末梢血管收縮,剌激心律加快,增加血糖濃度。人體攝入酪胺超過100 mg會引起偏頭痛癥狀,超過1080 mg會引起嚴(yán)重的中毒性腫脹。

        1.2 醬油中生物胺的形成機(jī)制

        從世界范圍看,中國是醬油起源最早的國家,醬油是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵型調(diào)味品,主要是由豆粕、面粉、麩皮和小麥等為原料,在多種微生物主要是曲霉屬真菌作用下發(fā)酵而成的。在醬油制作發(fā)酵過程中,在由米曲霉和大豆疫酶產(chǎn)生的蛋白酶的作用下,原料中的蛋白質(zhì)被水解成小分子的肽類、氨基酸和氨類[15]。醬油特有的風(fēng)味在發(fā)酵和老化過程中逐漸形成,同時形成了高含量的自由氨基酸,自由氨基酸的產(chǎn)生使醬油產(chǎn)生特有的風(fēng)味,同時可能也是生物胺潛在的主要來源。

        生物胺是醬油在長期發(fā)酵過程中非常容易產(chǎn)生的一類有害物質(zhì)。生物胺主要是由微生物脫羧酶在輔酶5-磷酸吡哆醛的作用下,作用于相應(yīng)的氨基酸,脫去羧基所形成的胺。生物胺的形成需要具備以下條件:存在可以分泌氨基酸脫羧酶的微生物;有相應(yīng)氨基酸的存在;有利于相關(guān)微生物生長,可以提高相應(yīng)脫羧酶活性的環(huán)境。

        2 生物胺的檢測方法

        目前,檢測生物胺的方法主要是高效液相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用法[16]、酶學(xué)測定法[17]等。其中最常用的是高效液相色譜法。由于高效液相色譜法較為成熟,可以同時測定一類物質(zhì)的多種類物質(zhì)的含量,本方法采用高效液相色譜方法同時測定最重要的2種生物胺——組胺和酪胺的含量。本研究測定了3種常見市售醬油中的組胺和酪胺含量,為消費者的飲食提供了一定的膳食指導(dǎo)。

        2.1 實驗材料與方法

        2.1.1 儀器設(shè)備

        Agilent 1260液相色譜儀(配紫外檢測器) Agilent公司;渦旋混合器 美國Talboys公司;高速離心機(jī) 日立公司;分析天平。

        2.1.2 試劑及材料

        乙腈、丙酮、甲醇:均為色譜純;乙酸銨、氨水(25%)、NaHCO3、氫氧化鈉、高氯酸:均為分析純;丹磺酰氯、組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品:Sigma-Adrich公司,純度均大于99%;實驗用水:均為雙蒸水,并經(jīng) Milli-Q超純水處理。廚邦味極鮮醬油、廚邦蒸魚豉油、李錦記蒸魚豉油、欣和六月鮮:均購自衡水吉美超市。

        2.2 實驗過程

        2.2.1 樣品預(yù)處理

        分別取2 mL醬油于10 mL離心管中,用0.4 mol/L高氯酸稀釋至刻度,置于渦旋混合器上混合5 min,待用[18]。

        2.2.1.1 樣品衍生化

        分別吸取0.1 mL樣液注入到螺帽瓶中,加入2 mol/L NaOH 0.2 mL溶液調(diào)節(jié)溶液pH值,飽和 NaHCO3溶液0.3 mL和丹磺酰氯丙酮溶液(10 mg/mL)1.0 mL,將上述混合物在40 ℃條件下于暗處攪拌30 min,然后加少量氨水使多余的丹磺酰氯沉淀,過濾,將上清液轉(zhuǎn)移到容量瓶中,用乙腈定容至5 mL,過0.45 μm濾膜后進(jìn)行色譜分析。

        2.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

        稱取一定量的組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)品,用 0.4 mol/L 高氯酸配制成濃度為 1 mg/mL 的組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,放于冰箱中4 ℃保存,每周一配。精確稱取適量丹磺酰氯,用丙酮溶解并配制成濃度為 10 mg/mL的溶液,經(jīng)過 0.45 μm 針頭微孔濾膜過濾器過濾后,于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.2.1.3 組胺和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的衍生化過程

        配制濃度為5,20,50,100,200,500 μg/mL的組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為2,8,20,40,80,200 μg/mL的酪胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,取0.1 mL含有不同濃度的組胺和酪胺的混標(biāo)溶液,具體衍生過程同2.2.1.1。

        2.2.2 色譜條件

        色譜條件:Agilent 1100色譜儀,流動相為V(乙腈)∶V(乙酸銨)為80∶20,進(jìn)行等度洗脫;流速:1 mL/min;色譜柱:Waters Nova-Pak C18(250 mm×4.6 mm) Column;配有紫外檢測器;檢測波長為254 nm,進(jìn)樣量為20 μL,柱溫 為40 ℃。

        2.3 結(jié)果與討論

        2.3.1 色譜條件

        實驗過程中選用了甲醇、乙腈、乙酸及乙酸胺等溶液搭配使用來選擇流動相,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈和乙酸銨搭配使用最為合適,本實驗之所以使用等度洗脫和梯度洗脫,是由于實驗中為了優(yōu)化測定色譜條件,減少整個測定過程的時間,消除其他干擾物質(zhì)的影響。

        考察了柱溫對組胺和酪胺出峰的影響后發(fā)現(xiàn)柱溫變化時組分出峰順序沒有變化,但分析時間隨柱溫升高而縮短。

        2.3.2 樣品提取

        本實驗采用水、鹽酸、甲醇、正丁醇、丙酮、三氯乙酸、高氯酸等溶劑作為提取溶劑進(jìn)行實驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn) 0.4 mol/L高氯酸溶液提取效果較好,因此選用0.4 mol/L高氯酸溶液作為提取劑。

        2.3.3 衍生化過程

        本文選用了鄰苯二甲醛、 磺酰氯二甲胺偶氮苯、丹磺酰氯、異硫氰酸苯酯、熒光胺、氯甲酸(9-芴醇)甲酯作為衍生試劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用丹磺酰氯進(jìn)行衍生效果很好,衍生方法也比較簡單。

        由于生物胺在弱堿性條件下才能與丹磺酰氯發(fā)生反應(yīng), 因此樣品在衍生前先用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性,再用碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié) pH至8.5~9.0。丹磺酰氯衍生在40 ℃條件下反應(yīng)30 min。當(dāng)衍生45,90,150 min實驗時,結(jié)果顯示在不同的衍生時間峰面積沒有明顯差異,因此,沒必要進(jìn)行太長時間的衍生過程。

        2.3.4 衍生物的穩(wěn)定性

        通過對 2 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品衍生物做穩(wěn)定性試驗,發(fā)現(xiàn)放置在4 ℃、避光條件下,衍生物在2周內(nèi)的峰面積變化不大,但第3周開始峰面積明顯降低。因此,衍生物在4 ℃、避光條件下,可保存2周。

        2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

        將上述配制成一系列濃度梯度的組胺和酪胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)行進(jìn)樣分析,在以上2種實驗條件下,分別進(jìn)行色譜分析,分別以組胺和酪胺的色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo),以相應(yīng)的濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果表明在上述2種色譜條件下,組胺在5~500 μg/mL,酪胺在2~200 μg/mL的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,線性回歸方程分別為:

        組胺:Y=16.6560+25.1341X,相關(guān)系數(shù)為r=0.99999;酪胺:Y=296.7579+29.3575X,相關(guān)系數(shù)為r=0.99990。

        其中,Y為生物胺的峰面積,X為衍生前對應(yīng)的生物胺的濃度。由此可見,峰面積和生物胺濃度呈良好的線性相關(guān)性,測定結(jié)果良好可靠。

        圖1 組胺和酪胺混標(biāo)溶液液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of mixed histamine and tyramine solution

        2.4 測得的結(jié)果

        測定4種市售醬油中組胺和酪胺的含量,結(jié)果見表1。

        表1 2種色譜條件下測得的醬油中組胺的含量Table 1 Determination of histamine in soy sauce under two chromatographic conditions

        由表1可知,在市售常見的這4種醬油中,廚邦蒸魚豉油中酪胺的含量最高,酪胺的含量為713.54 μg/mL,欣和六月鮮醬油中組胺的含量最高,組胺的含量為522.28 μg/mL。因此,在食用醬油時,根據(jù)醬油的品牌和種類控制食用量,否則對人體健康會造成很大的危害。

        2.5 加標(biāo)回收實驗

        為了進(jìn)一步評價2種色譜條件下測定的準(zhǔn)確度和精密度,本研究以廚邦味極鮮醬油為研究對象,在此樣品中分別添加組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液,制成濃度分別為1000,400,200 μg/mL組胺和濃度分別為800,320,160 μg/mL的酪胺加標(biāo)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實驗,結(jié)果見表2和表3。

        表2 組胺的加標(biāo)回收實驗Table 2 Recovery of histamine under different chromatographic conditions

        表3 酪胺的加標(biāo)回收實驗Table 3 Recovery of tyramine under different chromatographic conditions

        由表2和表3可知,組胺的加標(biāo)回收率在101.61%~112.82%之間,酪胺的加標(biāo)回收率在104.12%~112.92%之間。

        3 結(jié)論

        該研究針對組胺和酪胺測定的液相色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化,測定了常見的醬油中對人體危害最大的組胺和酪胺的含量,從而可以對不同人群的膳食指導(dǎo)做出一定的貢獻(xiàn)。關(guān)于食品中組胺的允許水平,我國規(guī)定了水產(chǎn)品中組胺的限量標(biāo)準(zhǔn)[19],鮐鲹魚類不得高于1000 mg/kg,其他紅肉魚類不得高于300 mg/kg。然而上述大豆發(fā)酵制品、酸奶和啤酒食品中組胺的含量也可能會比較高,我國卻尚未做出相關(guān)的限量規(guī)定,應(yīng)進(jìn)一步完善和健全食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系。

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