蔣孟圓，劉曉松，胡琳，馬曉年，歐利華，張秀清，李文廷*

(1.云南民族大學(xué)民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650500；2.昆明市疾病預(yù)防控制中心, 昆明 650228)

花椒為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)植物, 既是一種常用的食品調(diào)味料，被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一，又是一味傳統(tǒng)中藥[1]，含有多種對(duì)人體有益的活性成分，具有抑菌[2]、麻醉和興奮[3]、抑制血小板凝集、抗氧化等多種作用[4]，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值和研發(fā)潛力[5-7]?！侗静菥V目》記載花椒具有“散寒除濕、解郁結(jié)、消宿食、通三焦、溫脾胃、補(bǔ)右腎命門(mén)、殺蛔蟲(chóng)、止泄瀉”的作用[8]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》記載花椒具有“溫中止痛, 殺蟲(chóng)止癢”的作用。花椒對(duì)炭疽桿菌等10 種革蘭氏陽(yáng)性菌以及大腸桿菌等腸內(nèi)致病菌均有明顯的抑制作用,在油脂中加入定量的花椒油對(duì)人體具有一定的保健作用, 對(duì)食品也起到一定的防腐抗菌作用[9]，從而可提高產(chǎn)品的儲(chǔ)藏效果[10,11]。

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次生代謝物[12]，可引起動(dòng)物急性、亞急性和慢性中毒，其中某些真菌毒素具有致畸、致癌、致突變特性的嚴(yán)重影響[13]，其在食品中的污染問(wèn)題，已經(jīng)成為世界各國(guó)及有關(guān)國(guó)際組織關(guān)注的重點(diǎn)[14]。目前, 國(guó)內(nèi)外對(duì)花椒的化學(xué)成分[15,16]、藥理作用以及提取工藝有較深入的研究，而對(duì)其穩(wěn)定性的研究甚少，由于花椒及其油檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的不合理性，導(dǎo)致了重金屬、農(nóng)藥殘留和黃曲霉毒素等項(xiàng)目的監(jiān)測(cè)不足[17]。在抑菌活性測(cè)試中，花椒油在4 μL/mL時(shí)仍有桔青霉菌生長(zhǎng)[18]，花椒中黑曲霉的檢出率達(dá)到40%[19]，花椒在收獲、加工以及儲(chǔ)運(yùn)過(guò)程中容易受到多種真菌以及真菌毒素的污染，在日常生活中，自制花椒油中也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)霉變現(xiàn)象。為此，本研究主要對(duì)花椒油在存儲(chǔ)及食用過(guò)程中是否產(chǎn)生真菌毒素進(jìn)行研究分析。

近年來(lái)，在谷物、蔬菜、水果、畜牧產(chǎn)品以及中藥材中均發(fā)現(xiàn)了真菌毒素的存在。檢測(cè)真菌毒素的方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色譜法、免疫親和柱凈化高效液相色譜法，均檢測(cè)單一類(lèi)的真菌毒素[20-23]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度和較好的準(zhǔn)確度，逐漸成為同時(shí)檢測(cè)多種真菌毒素的主要方法，本研究將樣品前處理方法便捷化，通過(guò)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)法和各真菌毒素的外標(biāo)法結(jié)合定量，采取負(fù)離子掃描模式，建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)自制花椒油中11種真菌毒素的分析方法，為花椒油的健康食用提供安全保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent Technologies公司；串聯(lián)QTRAP 4500質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源) 美國(guó)AB SCIEX公司；XS205DU 型分析天平(十萬(wàn)分之一) 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Arium Pro D1純水處理終端機(jī) 德國(guó)Sartorius公司；Pribofast M226 多功能凈化柱 美國(guó)Pribolab公司；3H16RI型智能臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2 試劑

11種標(biāo)準(zhǔn)品: 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、3-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(3-ADON)、15-乙酰化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(15-ADON)、伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及13C-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇同位素：均購(gòu)自美國(guó)Pribolab公司; 質(zhì)控樣：購(gòu)自美國(guó)Romer Labs Diagnostic GmbH公司; 甲醇、乙腈：均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;實(shí)驗(yàn)中所用水為去離子水。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料

花椒油樣品：均為日常生活中食用的自制花椒油。花椒油的做法：將購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的新鮮或干燥的花椒直接放入70 ℃的植物油內(nèi)浸泡放置，食用時(shí)間最長(zhǎng)的花椒油樣品為24個(gè)月。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇分別將11種真菌毒素的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,13C-ADON稀釋為250 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液, 依據(jù)11種真菌毒素在質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)程度的不同, 將其配制成不同濃度的混標(biāo)溶液, 使用時(shí)用流動(dòng)相的初始比例溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液, 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液中均含有20 μL13C-ADON的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

1.4.2 樣品溶液的制備

精確稱(chēng)取花椒油樣品5.0 g,置于50 mL具塞樣品管中,加15 mL 70%甲醇水溶液,超聲提取1 h,離心5 min (10000 r/min),取5 mL上清液通過(guò)M226多功能凈化柱凈化。準(zhǔn)確量取2 mL凈化后的溶液,用氮吹儀濃縮近干,用流動(dòng)相初始比例溶液溶解并定容至1 mL,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,供儀器備用。

1.4.3 液相色譜條件

色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm),柱溫為40 ℃,流動(dòng)相為乙腈(A)+0.2%氨水溶液(B),流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為5 μL,檢測(cè)分析時(shí)間為6.0 min。

1.4.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，溫度: 550 ℃；離子噴霧電壓(ionspray voltage)：-4500.0 V；氣簾氣(curtain gas):25 psi；霧化氣(gas 1)：55 psi；輔助氣(gas 2)：55 psi；負(fù)離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)。將分別配制成250 μg/L的12種真菌毒素甲醇溶液在流動(dòng)注射狀態(tài)下，通過(guò)Q1 MS全掃描模式得到各真菌毒素的母離子(M1-)m/z，Product Ion Scan(MS2)碎片離子掃描模式得到次級(jí)碎片離子信息,采取峰值較高的2個(gè)碎片離子作為定量離子和定性離子,對(duì)質(zhì)譜中與檢測(cè)化合物相關(guān)的參數(shù)通過(guò)MRM掃描模式進(jìn)行優(yōu)化，詳細(xì)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 12種真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum parameters for 12 kinds of mycotoxins

續(xù) 表

注：“*”為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相種類(lèi)和比例的選擇

本研究考察了流動(dòng)相分別為乙腈-水、甲醇-水、甲醇-氨水和乙腈-氨水的實(shí)驗(yàn), 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：以乙腈(A)-0.2%氨水(B)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，具有較高的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng), 峰形對(duì)稱(chēng)，結(jié)果較為理想，梯度洗脫程序?yàn)?0～0.5 min，95% B～70% B;0.5～3.0 min，70% B～40% B; 3.0～3.5 min，40% B～5% B; 3.5～4.5 min，5% B; 4.5～5.0 min，5% B～80% B; 6.0 min，95% B。依據(jù)最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下得到11種真菌毒素的MRM色譜圖，總離子圖見(jiàn)圖1，其余各真菌毒素的碎片離子圖見(jiàn)圖2。

圖1 11種真菌毒素的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

圖2 11種真菌毒素的碎片離子MRM色譜圖Fig.2 MRM fragment ion chromatogram of 11 kinds of mycotoxins

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系考察

依據(jù)在質(zhì)譜MRM模式下響應(yīng)程度的不同，將11種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制為不同濃度范圍的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以定量離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)，以質(zhì)量濃度(μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 11種真菌毒素的線性參數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear parameters, limit of detections and limit of quantifications of 11 kinds of mycotoxins

2.2.2 檢出限及定量限

將真菌毒素混合溶液最低濃度點(diǎn)稀釋進(jìn)行測(cè)定, 以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算檢出限(limit of detection, LOD)，10倍信噪比對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算定量限(limit of quantity, LOQ)，具體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

2.2.3 加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取18份5.0 g花椒油樣品，添加低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度1.0，2.0，5.0 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度進(jìn)行6個(gè)水平測(cè)定，按照1.4.2前處理?xiàng)l件進(jìn)行處理并測(cè)定，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的精密度，11種真菌毒素的回收率為68.5%～102.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～6.87%，具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 真菌毒素的加標(biāo)回收率(n=6)Table 3 Recoveries of mycotoxins (n=6) %

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別進(jìn)樣5 μL放置0，5，10，24，48 h后的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,由峰面積計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差, 黃曲霉毒素B1為0.79%，黃曲霉毒素B2為0.68%，黃曲霉毒素G1為0.74%，黃曲霉毒素G2為0.81%，玉米赤霉烯酮為1.76%，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇為1.89%，3-乙?；撗跹└牭毒┐紴?.21%，15-乙?；撗跹└牭毒┐紴?.34%，伏馬毒素B1為3.57%，伏馬毒素B2為3.64%，伏馬毒素B3為4.21%，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明各真菌毒素在48 h內(nèi)處于穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2.5 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g不同濃度的真菌毒素質(zhì)控樣各3份，按照1.4.2前處理?xiàng)l件進(jìn)行處理質(zhì)控樣品，各真菌毒素的檢測(cè)值均在參考值允許范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明樣品提取效率較高，實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度良好，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 準(zhǔn)確度數(shù)據(jù)Table 4 Accuracy data μg/kg

2.3 討論

2.3.1 提取液的選擇

本研究選擇甲醇、乙腈以及兩者的不同濃度水溶液作為提取液，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液以及加標(biāo)回收率的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明使用70%的甲醇水具有較高的提取率，檢測(cè)結(jié)果較為理想。

2.3.2 基質(zhì)效應(yīng)的影響

采用甲醇溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作液以及采用花椒油樣品作為基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)樣品處理后進(jìn)行11種真菌毒素的檢測(cè)分析，實(shí)驗(yàn)表明花椒油的基質(zhì)效應(yīng)對(duì)11種真菌毒素的檢測(cè)沒(méi)有較大影響。

2.3.3 樣品的凈化

本研究進(jìn)行多功能凈化柱和0.22 μm濾頭直接過(guò)濾的凈化對(duì)比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：2種凈化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并無(wú)較大差別，信噪比結(jié)果一致，加標(biāo)回收率結(jié)果沒(méi)有較大差異。對(duì)花椒油中11種真菌毒素的檢測(cè)可以選擇0.22 μm濾頭進(jìn)行凈化操作，從而提高樣品的檢測(cè)效率，降低經(jīng)濟(jì)成本。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)食用不同時(shí)長(zhǎng)的花椒油樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，均未檢測(cè)出11種真菌毒素，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：日常食用的自制花椒油在短期儲(chǔ)存內(nèi)不易滋長(zhǎng)已知的真菌毒素，在花椒油中浸泡的花椒雖然出現(xiàn)了白色的霉菌，但亦未檢出11種真菌毒素?；ń酚碗m然有抑菌作用，也未檢出常見(jiàn)的真菌毒素，但仍然會(huì)有其他細(xì)菌及真菌毒素如黑曲霉素的產(chǎn)生，因此為了食用的健康安全，要做好花椒油的存儲(chǔ)工作，出現(xiàn)霉變現(xiàn)象最好不要繼續(xù)食用。超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定11種真菌毒素的方法具有較好的加標(biāo)回收率，較高的準(zhǔn)確度，前處理便捷，適用于花椒油中多種真菌毒素的快速檢測(cè)。