姚茹 張銳虎 王璐 王晨陽 郭民 宋國華 陳朝陽

中圖分類號 R965 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）17-2364-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.17.14

摘 要 目的：考察蓮心堿對佛波酯（TPA）所致耳腫脹炎癥模型小鼠的抗炎作用，并探討其作用機制。方法：將40只小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組（地塞米松，2.5 mg/kg）和蓮心堿低、高劑量組（5、15 mg/kg），每組8只。除空白組外，其余各組小鼠均于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹TPA建立耳腫脹炎癥模型；造模同時，各給藥組小鼠均按20 ?L/只于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹相應(yīng)藥液（以丙酮為溶劑），空白組和模型組小鼠涂抹等體積丙酮溶液。給藥6 h后，測定小鼠耳厚度和耳腫脹度，蘇木精-伊紅染色后觀察小鼠耳組織病理學(xué)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠耳組織中炎癥因子[腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-1β]水平，Western blot法測定小鼠耳組織中核轉(zhuǎn)錄因子κB信號通路相關(guān)蛋白[NF-κB p65和NF-κB 抑制蛋白（IκBα）]的磷酸化水平，并采用實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測小鼠耳組織中環(huán)氧化酶2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）mRNA表達。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠耳厚度、耳腫脹度和耳組織中炎癥因子水平、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平以及COX-2、iNOS mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05）；耳組織發(fā)生增厚、炎性細胞浸潤增多等變化。與模型組比較，各給藥組小鼠耳厚度、耳腫脹度及耳組織中上述指標(biāo)水平均顯著降低（P<0.05），耳組織增厚和炎性細胞浸潤等均得到顯著減輕。結(jié)論：蓮心堿對TPA所致耳腫脹炎癥模型小鼠具有較好的抗炎作用，其機制可能與抑制耳組織中NF-κB p65、NF-κB蛋白的磷酸化，進而抑制炎癥因子COX-2、iNOS mRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞 蓮心堿；耳腫脹炎癥模型；炎癥因子；核轉(zhuǎn)錄因子κB p65；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the anti-inflammatory effects of liensinine on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate （TPA）-induced ear edema inflammatory model mice， and to investigate its mechanism. METHODS： The 40 mice were randomly divided into blank group， model group， positive control group （dexamethasone， 2.5 mg/kg） and liensinine low-dose and high-dose groups （5， 15 mg/kg）， with 8 mice in each group. Except for blank group， other groups were given TPA for external use on both inner and outer sides of right ear to induce ear edema inflammatory model. During modeling， administration group was given relevant medicine 20 ?L/mice for external use on both inner and outer sides of right ear （using acetone as solvent）； blank group and model group were given constant volume of acetone. 6 h after administration， ear thickness and ear edema degree of mice were determined. The pathological changes of ear tissue were observed by HE staining. The levels of inflammatory factors （TNF-α， IL-6， IL-1β） in ear tissue were detected by ELISA. The phosphorylation levels of nuclear factor κB （NF-κB） signaling pathway related protein [NF-κB p65， NF-κB inhibitory protein （IκBα）] were detected by Western blot assay. mRNA expressions of COX-2 and iNOS were detected by RT-PCR. RESULTS： Compared with blank group， degree of ear edema， the levels of inflammatory factors in ear tissue， phosphorylation levels of NF-κB signaling pathway related protein， mRNA expressions of COX-2 and iNOS were increased significantly （P<0.05）. There were ear tissue thickening and increase of inflammatory cell infiltration， etc. Compared with model group， ear edema degree and above indexes of ear tissue in administration group were decreased significantly （P<0.05）； ear tissue thickening and increase of inflammatory cell infiltration were relieved significantly. CONCLUSIONS： Liensinine shows good anti-inflammatory effects on TPA-induced ear edema inflammatory model mice， the mechanism of which may be associated with inhibiting the phosphorylation levels of NF-κB p65 and NF-κB protein and inhibiting the mRNA expressions of inflammatory factors COX-2 and iNOS.

KEYWORDS Liensinine； Ear edema inflammatory model； Inflammatory factor； Nuclear factor κB p65； Mice

人和嚙齒類動物在局部接觸外源性刺激物時，可能會發(fā)生刺激性接觸性皮炎或過敏性接觸性皮炎[1]。長期接觸刺激物可引起皮膚屏障破壞和皮膚穩(wěn)態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致炎性皮膚病[2]。臨床上一些皮膚病治療藥物含有激素，具有一定的副作用，且容易引起藥物依賴性皮炎[3]。因此，篩選一種副作用小的中草藥提取物作為皮膚炎癥的外用治療具有重要意義。

蓮心堿（Liensinine）是從蓮子心中提取的一種雙芐基四氫異喹啉類生物堿[4]。據(jù)文獻報道，蓮心堿可抑制大鼠腦缺血灌注后炎癥因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）的表達[5]；另外，其還可增加超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）活性，減少丙二醛（MDA）的含量，改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷[6]。而TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子可促進氧自由基的過多累積，致氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。雖然研究報道顯示出蓮心堿具有一定的抗炎作用，但是其具體的作用機制尚不清楚。核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）是一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，參與炎癥機制的調(diào)控。各種炎性刺激通過促進胞漿中NF-κB 抑制蛋白（IκBα）的降解和磷酸化，釋放NF-κB入核后，可上調(diào)環(huán)氧化酶2（COX-2）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）等炎性基因和TNF-α、IL-1β等促炎因子的表達[8]。本研究利用佛波酯（TPA）誘導(dǎo)局部炎癥模型，觀察蓮心堿對耳腫脹炎癥模型小鼠的抗炎作用，并從NF-κB通路出發(fā)探討其作用機制。

1 材料

1.1 儀器

215-151-10數(shù)字測厚儀（日本Mitutoyo公司）；Epoch微孔分光光度計（美國Bio-Tek公司）；3-18k高速微量離心機（美國Sigma公司）；BX51倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；G-Box Chemixx9化學(xué)發(fā)光成像儀（英國Syngene公司）；StepOnePlus實時熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI公司）。

1.2 藥品與試劑

蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，批號：2586-96-1，純度：≥98%）；地塞米松原料藥（批號：530B052，純度：≥98%）、TPA（批號：16561-29-8，純度：≥98%）均購自北京索萊寶生物科技有限公司；TNF-α、IL-6、IL-1β 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司，批號分別為20161125、20160728、20171018）；兔源NF- κB p65（NF-κB p65）、小鼠源IκBα、兔源磷酸化IκBα（p-IκBα）、兔源磷酸化NF- κB p65（p-NF-κB p65）單克隆抗體和抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）標(biāo)記的辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗、抗兔IgG 標(biāo)記的HRP偶聯(lián)二抗菌購自美國CST公司；β-肌動蛋白（β-actin）、COX-2、iNOS引物均由生物工程（上海）有限公司合成；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

清潔級ICR小鼠40只，♀，6～8周齡，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015-001）。動物實驗在該中心屏障環(huán)境動物實驗室中進行（實驗動物使用許可證號：SYXK（晉）2015- 001）。實驗期間小鼠自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為20～24 ℃，相對濕度為40%～70%，明暗各12 h交替。

2 方法

2.1 小鼠耳腫脹炎癥模型的建立與給藥

將40只小鼠隨機分為5組，分別為空白組、模型組、陽性對照組（地塞米松，2.5 mg/kg）[9]和蓮心堿低、高劑量組（5、15 mg/kg）[10]，每組8只。除空白組外，其余各組小鼠均于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹20 μL TPA致炎[11]。并于造模同時，各給藥組小鼠均按20 ?L/只于右耳內(nèi)外側(cè)涂抹相應(yīng)藥液（以丙酮為溶劑），空白組和模型組小鼠涂抹等體積丙酮溶液。

2.2 耳腫脹情況及組織病理學(xué)的觀察

給藥6 h后，用數(shù)字測厚儀測量各組小鼠的耳厚度。然后頸椎脫臼處死小鼠，用打孔器（d=6 mm）打孔取雙耳相同部位組織，以右耳質(zhì)量（mg）/左耳質(zhì)量（mg）計算耳腫脹度。并將耳組織用4%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋，切成10 μm薄片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察各組小鼠耳組織病理學(xué)變化。

2.3 耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平測定

分別取同一部位耳組織，稱質(zhì)量，按質(zhì)量（g） ∶ 體積（mL）=1 ∶ 9的比例加入生理鹽水，在冰浴條件下剪碎組織，制成10%組織勻漿，然后以3 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用ELISA法檢測各組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進行。

2.4 耳組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達水平檢測

采用Western blot 法測定各組小鼠耳組織中IκBα 、NF-κB p65、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平。取同一部位耳組織，用液氮研磨成粉末，移入1.5 mL EP管中，加入200 μL含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，進行充分裂解，然后以1 2000 r/min離心10 min，取上清測總蛋白濃度。加入上樣緩沖液，蛋白煮沸變性，上樣30 μg進行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜后，用5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應(yīng)一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過夜；然后加入相應(yīng)二抗（1 ∶ 100），室溫下孵育1 h。TBST緩沖液洗滌后，超敏化學(xué)發(fā)光液（ECL）發(fā)光，化學(xué)發(fā)光成像儀上檢測目的蛋白IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65和內(nèi)參β-actin蛋白表達，通過Image J軟件對各蛋白條帶灰度值進行定量，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值的比值來反映目的蛋白的表達水平。

2.5 耳組織中iNOS、COX-2 mRNA表達水平檢測

采用實時熒光定量-PCR法檢測各組小鼠耳組織中iNOS、COX-2 mRNA表達水平。取小鼠同一部位耳組織，于液氮中研磨，采用TRizol法提取耳組織中總RNA，微孔板分光光度計檢測260 nm和280 nm波長下的吸光度值，進行RNA含量和純度檢測。然后按照10 μL反應(yīng)體系使用500 ng的總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。將cDNA產(chǎn)物3倍稀釋后，進行實時熒光定量-PCR擴增。引物序列：COX-2上游引物序列為5′ -CTGGAACATGGACTC ACTCAGTTTG-3′ ，下游引物序列為5′ -AGGCCTTTGCCACTGCTTGTA-3′ ，擴增產(chǎn)物大小為109 bp；iNOS上游引物序列為5′ -CAAGCACATTTGGGAATGGAGA-3′ ，下游引物序列為：5′ -CAGAACTGAGGGTACATGCTGGAG-3′ ，擴增產(chǎn)物大小為136 bp；內(nèi)參（β-actin）上游引物序列為5′ -ATCTGGCACCACACCTTC-3′ ，下游引物序列為5′ -AGCCAGGTCCAGACGCA-3′ ，擴增產(chǎn)物大小為291 bp。反應(yīng)體系：20 μL。反應(yīng)條件：采用兩步法，即95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔct法進行分析，式中ct表示達到設(shè)定閾值的循環(huán)次數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 耳厚度和耳腫脹度測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳厚度和耳腫脹度顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠耳厚度和耳腫脹度均顯著降低（P<0.05），且蓮心堿的作用具有一定的量效關(guān)系。各組小鼠耳厚度和耳腫脹度測定結(jié)果見表1。

3.2 耳組織病理學(xué)觀察結(jié)果

與空白組比較，模型組可見耳部明顯增厚，鱗狀上皮過度角化，細胞間及細胞內(nèi)水腫，炎性細胞浸潤明顯，伴有毛細血管擴張充血；與模型組比較，各給藥組小鼠耳部鱗狀上皮輕度角化，細胞間及細胞內(nèi)水腫不明顯，炎性細胞浸潤減少，毛細血管輕度擴張充血。各組小鼠耳組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖1。

3.3 耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均顯著降低（P<0.05），且蓮心堿的作用具有一定的量效關(guān)系。各組小鼠耳組織中TNF-α、IL-6、IL-1β水平測定結(jié)果見表2。

3.4 耳組織中IκBα、NF-κB p65蛋白磷酸化水平測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳組織中IκBα發(fā)生降解，IκBα蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組小鼠耳組織中IκBα降解受到抑制， IκBα蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），p-IκBα、p-NF- κB p65蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。各組小鼠耳組織中IκBα、NF-κB p65、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達的電泳圖見圖2，測定結(jié)果見表3。

3.5 耳組織中iNOS 、 COX-2 mRNA 表達水平測定結(jié)果

與空白組比較，模型組小鼠耳組織中iNOS 、COX-2 mRNA的表達水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠耳組織中iNOS 、COX-2 mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05）。各組小鼠耳組織中iNOS 、COX-2 mRNA表達水平測定結(jié)果見表4。

4 討論

采用簡便易行的外用涂抹方法對皮膚炎癥進行局部治療，能夠避免口服靜脈途徑帶來的全身副作用[12]。TPA誘導(dǎo)小鼠耳腫脹炎癥模型是化學(xué)接觸性皮膚炎癥的經(jīng)典動物模型，表現(xiàn)為小鼠耳組織角質(zhì)形成細胞增生，產(chǎn)生TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性細胞因子，炎性細胞浸潤增多，角質(zhì)層明顯增厚，耳組織增厚和耳質(zhì)量增加等[13]。本研究采用TPA誘導(dǎo)小鼠耳腫脹炎癥小鼠模型，并以一種抗炎效果較好的強效類固醇激素——地塞米松為陽性對照，來驗證蓮心堿的抗炎作用。結(jié)果顯示，涂抹TPA后，小鼠耳厚度和耳腫脹度明顯增加，而蓮心堿和地塞米松涂抹給藥后均可顯著降低小鼠耳厚度和耳腫脹度。進一步的組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠耳組織中炎性細胞浸潤增加，耳組織腫脹；而蓮心堿和地塞米松給藥組小鼠耳組織炎性細胞浸潤減少，耳組織腫脹減輕。

TNF-α是一種自分泌刺激因子，可由角質(zhì)形成細胞中的巨噬細胞產(chǎn)生，是皮膚炎癥中的關(guān)鍵細胞因子和細胞介質(zhì)[14]。IL-6作為炎癥反應(yīng)介質(zhì)，在皮膚感染過程中通過增加血管通透性，對皮膚水腫的形成起促進作用[15]。IL-1β是炎癥性和免疫性皮膚病的主要介質(zhì)，炎癥和免疫刺激均可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細胞中的IL-1β產(chǎn)生和分泌[16]。本研究檢測了小鼠耳組織中炎性細胞因子的分泌水平。結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL- 1β的含量明顯升高；而蓮心堿和地塞米松處理后降低了TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌水平，證實了蓮心堿對皮膚炎癥的局部抗炎作用。

NF-κB是一種核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)炎性細胞因子的表達在免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[17]。靜息狀態(tài)下，NF-κB的亞基p50和p65通常以異二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中。當(dāng)促炎刺激物（如TNF-α）作用于細胞時，會通過IκBα的降解和磷酸化來活化NF-κB，活化的NF-κB p65進入細胞核內(nèi)與DNA結(jié)合，上調(diào)炎癥基因COX-2、iNOS的轉(zhuǎn)錄[18]。NF-κB被激活并啟動促炎癥基因的轉(zhuǎn)錄和表達，導(dǎo)致TNF-α、IL-6、IL-1β等多種促炎因子的過度分泌[19]，從而加重炎癥損傷。在本研究中，涂抹TPA后，可促進小鼠耳組織中IκBα、NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，從而上調(diào)炎癥基因iNOS和COX-2 mRNA的表達；蓮心堿給藥后可明顯抑制IκBα、NF-κB p65蛋白磷酸化的發(fā)生，抑制炎癥基因iNOS和COX-2 mRNA的表達，從而減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蓮心堿對TPA誘導(dǎo)的小鼠耳腫脹具有抗炎作用，其作用機制可能為抑制IκBα和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，進而抑制炎癥基因iNOS、COX-2 mRNA的表達有關(guān)。

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（收稿日期：2018-02-01 修回日期：2018-07-01）

（編輯：林 靜）