浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理研究所，浙江 杭州 311402

乳頭皸裂(nipple trauma)作為哺乳期的常見病之一，在世界各地具有較高的發(fā)病率，處理不當(dāng)時(shí)可以引起局部滲血、潰瘍甚至導(dǎo)致乳癰。研究顯示，由于乳頭皸裂所引起的疼痛和焦慮通常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)婦放棄母乳喂養(yǎng)和早期斷奶[1-2]。然而，母乳中包含大量對(duì)嬰兒有益的生物活性物質(zhì)，具有營養(yǎng)、抗菌及免疫調(diào)節(jié)等多種功能，對(duì)母親而言可以幫助子宮收縮、減少乳腺癌和卵巢癌等的危險(xiǎn)[3]。因此，乳頭皸裂的治療對(duì)推進(jìn)母乳喂養(yǎng)顯得至關(guān)重要。

中醫(yī)驗(yàn)方蛋黃油，古籍中稱為“雛鳳膏”，性平，味甘，具有解毒消腫，斂瘡生肌之效[4]。蛋黃油的臨床應(yīng)用歷史悠久，始見于北周姚僧垣撰《集驗(yàn)方·卷九》，云：“治湯火燒瘡方，熟雞子一十個(gè)，取黃，炒取油，入十文膩粉，攪勻，用雞翎掃瘡上，三、五日，永除瘢痕”[5]。此外在《本草綱目》等諸多書籍中均有記載[6]。研究表明，蛋黃油中含有脂肪類、蛋白質(zhì)氨基酸類、維生素、礦物質(zhì)四類成分，其中維生素A、維生素D和卵磷脂等物質(zhì)對(duì)人體皮膚的再生和代謝有著重要作用[7]。此外，雛鳳膏中還添加有芝麻油和純天然羊毛脂。關(guān)于蛋黃油用于燙傷、乳頭皸裂等的研究[8-10]已有報(bào)道，但是雛鳳膏治療乳頭皸裂的具體機(jī)制研究還未見報(bào)道。研究針對(duì)雛鳳膏對(duì)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A細(xì)胞的增殖影響及機(jī)制展開深入的探究，希望為雛鳳膏應(yīng)用于乳頭皸裂的治療提供理論依據(jù)，從而進(jìn)一步推進(jìn)母乳喂養(yǎng)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A購買于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫

1.2 雛鳳膏的制備 蛋黃油提取物1份;芝麻油0.5～1.5份;純天然羊毛脂1.5～2.5份。其中，所述的蛋黃油提取物的制備方法如下：

將雞蛋煮熟，剝?nèi)〉包S，壓碎，用食品級(jí)乙酸乙酯冷浸或超聲提取，得到的提取液減壓回收乙酸乙酯，得到所述的蛋黃油提取物。

取純羊毛脂4份，置于容器中，加熱至約45?C，將羊毛脂熔化，再加入2份蛋黃油中間體，1份芝麻油基質(zhì)，熔合，不斷攪拌，冷卻至室溫，即得雛鳳膏。

1.3 試劑 MCF 10A專用培養(yǎng)基(Lonza公司批號(hào)cc-4136)；0.25% Trypsin-EDTA (GENVIEW 公司批號(hào)49120010100)；青霉素-鏈霉素(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司批號(hào)12123101)；RIPA裂解液(碧云天生物批號(hào)P0013C)；碧云天BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司批號(hào)P0011)；四甲基亞唑藍(lán)(MTT)(美國SIGMA公司批號(hào)M2128)；DMSO(美國SIGMA公司批號(hào)WXBB1799V)；細(xì)胞周期染色液(BD公司批號(hào) 5205995)；一抗cyclin E1、cdk2(戴格生物科技生物有限公司批號(hào) db1668、db299、)、p21(abcam公司批號(hào) 18209)、β-Actin、β-Tubulin(CST公司批號(hào) #4970、#2128)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(BIO-RAD公司批號(hào)350001312)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(BIO-RAD公司批號(hào)350003248)；ECL顯影液(BIO-RAD公司批號(hào)102030719)

1.4 儀器 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；ECLIPSE Ti型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；BSA124S-CW電子天平(北京賽多利斯電子有限公司)；L500型臺(tái)式離心機(jī)(湖南相儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；HHS-11-1型恒溫水浴箱(上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠)；MDF-U3386S 型超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；轉(zhuǎn)移脫色搖床(姜堰市普康醫(yī)療機(jī)械廠)；電泳儀(美國BIO-RAD公司)；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國CLinX公司)；guava流式細(xì)胞儀(美國Minipore公司)；移液槍(多規(guī)格)(德國Eppendorf公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF 10A細(xì)胞株培養(yǎng)于MCF 10A專用培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，大豆胰蛋白酶抑制劑抑制消化，按1∶3傳代，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2000個(gè)/孔，每孔100 μL加入到96孔板，置37 ℃含有5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后加入雛鳳膏，其藥液終濃度分別為0 μg·mL-1、5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1,用藥組和對(duì)照組均設(shè)8個(gè)復(fù)孔繼續(xù)培養(yǎng)96 h，每孔加入20 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后每孔加入 200 μL 三聯(lián)液使藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚溶解，18 h 后用酶標(biāo)儀在 570 nm 處測(cè)定其 OD 值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，以平均值統(tǒng)計(jì)結(jié)果，計(jì)算各濃度下細(xì)胞相對(duì)存活率。細(xì)胞活力(%)=(加藥組OD570-空白組OD570)/(對(duì)照組OD570-空白組OD570)×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、60 μg·mL-1雛鳳膏組、120 μg·mL-1雛鳳膏組。將狀態(tài)良好的乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A以3×105/孔傳代于6 cm皿中，等待細(xì)胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度的雛鳳膏的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后用PBS洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細(xì)胞，洗滌離心后立即加入70%的冰乙醇，保存在4 ℃過夜，細(xì)胞固定好之后，將前一天的細(xì)胞懸液在離心機(jī)上離心，吸去用于固定的乙醇，再用冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，除去上清液，加入含有RNase的PI染液，避光室溫染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)每組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白及與生長有關(guān)蛋白 實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組、60 μg·mL-1雛鳳膏組、120 μg·mL-1雛鳳膏組。將狀態(tài)良好的乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A以3×105/孔傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，等待細(xì)胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度的雛鳳膏的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，各組細(xì)胞加入裂解液，冰上裂解30 min后離心(12000 r·min-1)取上清，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，處理蛋白隨后上樣，用SDS-PAGE分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入Cyclin E1、Cdk2、p21、EGFR、p-EGFR、Erk、p-Erk、GAPDH抗體孵育過夜后，加入相對(duì)的二抗(1∶3000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL法顯影，化學(xué)發(fā)光后拍照。GAPDH用于蛋白的內(nèi)參。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，當(dāng)*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 雛鳳膏對(duì)MCF 10A細(xì)胞增殖活性的影響 用不同濃度的藥物雛鳳膏(0，5，10，20，40,80,160 μg·mL-1)處理MCF 10A細(xì)胞72 h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，并繪制量效曲線(表1、圖1)。通過MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雛鳳膏對(duì)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A具有明顯的增殖作用并具有劑量依賴性。

3.2 雛鳳膏對(duì)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A周期的影響

3.2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果 本研究采用不同濃度的雛鳳膏對(duì)MCF 10A細(xì)胞處理72 h后用PI單染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化情況，結(jié)果顯示，雛鳳膏能加快MCF 10A的G1/S期轉(zhuǎn)換，增加其S期細(xì)胞數(shù)目，見表2、圖2。

表1 雛鳳膏對(duì)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A細(xì)胞活力的影響

表2 不同濃度的雛鳳膏 (0、60、120 μg·mL-1)處理72 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF 10A細(xì)胞周期變化

3.2.2 Western Blot檢測(cè)周期相關(guān)蛋白 Western Blot 結(jié)果顯示(表3、圖3)，用雛鳳膏處理72 h后的MCF 10A細(xì)胞G1/S期相關(guān)蛋白Cyclin E1，cdk2以及p21的表達(dá)發(fā)生了變化。Cyclin E1，cdk2 蛋白表達(dá)水平升高，p21蛋白表達(dá)水平降低，表明雛鳳膏促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A增殖是通過加快細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換實(shí)現(xiàn)的。

3.3 雛鳳膏對(duì)乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A EGFR/Erk通路的影響

3.3.1 Western Blot檢測(cè)EGFR/Erk通路相關(guān)蛋白 Western Blot 結(jié)果顯示(表4、圖4)，用雛鳳膏處理72h后的MCF 10A細(xì)胞EGFR/Erk通路相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生變化。即p-EGFR、p-Erk蛋白表達(dá)升高，表明雛鳳膏促進(jìn)MCF 10A增殖可能與EGFR/Erk通路有關(guān)。

表3 不同濃度的雛鳳膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A細(xì)胞72 h后，Image J 計(jì)算cyclin E1、cdk2、p21蛋白的總灰度值變化，β-tubulin 作為內(nèi)參對(duì)照。

表4 不同濃度的雛鳳膏(0、60、120 μg·mL-1)作用于MCF 10A細(xì)胞72 h后，Image J 計(jì)算p-EGFR、EGFR、p-Erk、Erk蛋白的總灰度值變化，β-actin 作為內(nèi)參對(duì)照。

4 討論

乳頭皸裂作為哺乳期的常見病之一，已經(jīng)成為產(chǎn)婦放棄母乳喂養(yǎng)的主要原因之一，雖已有藥物治療乳頭皸裂，但考慮到里面的添加劑對(duì)嬰兒的危害，大多數(shù)產(chǎn)婦不愿使用，而雛鳳膏作為一種中醫(yī)驗(yàn)方，來源純天然、沒有添加劑、無毒副作用，具有“生肌長肉”的功效。本實(shí)驗(yàn)利用MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雛鳳膏對(duì)于乳腺上皮細(xì)胞MCF 10A具有明顯的增殖作用，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。隨后，對(duì)雛鳳膏促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的機(jī)制進(jìn)行研究。而細(xì)胞生長、增殖的調(diào)控主要跟細(xì)胞周期和信號(hào)通路等有關(guān)。

細(xì)胞周期(cell cycle)是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖，包括G1、S、G2、M四個(gè)階段。在G1/S與G2/M兩個(gè)過渡期各有一個(gè)檢查點(diǎn)，分別制止G1期受損DNA進(jìn)入S期進(jìn)行復(fù)制和G2期受損DNA進(jìn)入M期進(jìn)行有絲分裂，從而中止細(xì)胞周期[11]。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示雛鳳膏能夠使MCF 10A細(xì)胞雛鳳膏能加快MCF 10A的G1/S期轉(zhuǎn)換，增加其S期細(xì)胞數(shù)目，達(dá)到促進(jìn)增殖的作用。細(xì)胞周期受細(xì)胞精確、有序的調(diào)控，其中，細(xì)胞周期蛋白E( cyclin E)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin- dependent kinase 2, cdk 2) 是細(xì)胞周期調(diào)控中的關(guān)鍵大分子之一，cyclin E與cdk2結(jié)合，成為細(xì)胞從G1進(jìn)入S期的關(guān)鍵激酶復(fù)合物[12-14]P21蛋白能夠抑制各種Cyclin E-cdk 2復(fù)合物的活性，負(fù)性調(diào)節(jié)Cyclin E- cdk 2 功能。Western Blot結(jié)果顯示雛鳳膏能夠引起MCF 10A細(xì)胞G1/S期相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，即上調(diào)cyclin E1、cdk 2的表達(dá)，下調(diào)p21的表達(dá)，表明雛鳳膏通過加快MCF 10A細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換，加快細(xì)胞周期進(jìn)程，達(dá)到促進(jìn)增殖的目的。

表皮生長因子(EGFR)作為一種膜受體，二聚體化和磷酸化后，與其下游相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子發(fā)生相互作用，并將其激活。這些信號(hào)通路包括MEK/ERK及PI3K/AKT 信號(hào)通路等[15-16]，通過這些信號(hào)通路將有絲分裂的信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而有效調(diào)節(jié)細(xì)胞增生、分化及生長等[17-18]?；谏鲜鯡GFR對(duì)細(xì)胞生長、增殖的調(diào)控作用，我們推測(cè)雛鳳膏的促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖可能與促進(jìn)EGFR的活化有關(guān)。Western Blot結(jié)果顯示雛鳳膏能夠促進(jìn)MCF 10A 的EGFR的磷酸化，并且還同時(shí)促進(jìn)Erk的磷酸化，且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。因此，推測(cè)雛鳳膏促進(jìn)MCF 10A的增殖可能與激活EGFR/Erk通路有關(guān)。

雛鳳膏作為一種中醫(yī)驗(yàn)方，純天然、無毒，營養(yǎng)豐富，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雛鳳膏可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與縮短細(xì)胞周期、激活EGFR/Erk通路有關(guān)，希望為雛鳳膏臨床治療乳頭皸裂提供理論依據(jù)，從而推進(jìn)母乳喂養(yǎng)。