曾一文 黎潔瑤 田曠怡 于濤 許稷豪 陳其奎

目前，結(jié)腸癌已成為世界第三高發(fā)腫瘤，在中國其致死率已達到第4位[1-2]。結(jié)腸癌的主要病理類型為結(jié)腸腺癌，人類大部分結(jié)腸腺癌呈現(xiàn)“早期癌前病變的異常隱窩灶(ACF)-腺瘤-腺癌”的發(fā)展規(guī)律[3]。在結(jié)腸癌研究中，使用氧化偶氮甲烷(AOM)這一致癌劑已成為嚙齒類動物結(jié)腸癌化學誘導建模的主要方法之一[4-5]。但不同研究使用AOM的藥物濃度及藥物暴露時間不一，AOM對小鼠結(jié)腸腫瘤的誘導效果結(jié)論不一[6-7]。而在AOM基礎(chǔ)上聯(lián)合使用葡聚糖硫酸鈉(DSS)這一促炎劑，在減少建模時間的同時可提高成瘤數(shù)量及體積。然而，不同的研究采用不同的DSS給藥循環(huán)方案，報道的結(jié)腸癌成模效果/效率不一，尚未有研究比較DSS不同循環(huán)方案小鼠的成模效果/效率，以便研究者根據(jù)自己的研究需要選擇合適的誘導方案并加以優(yōu)化[8-9]。本實驗擬研究C57BL/6J小鼠在單獨給予不同劑量AOM或AOM聯(lián)合不同循環(huán)方案的2%DSS在不同暴露時間下結(jié)腸癌的誘導效率，探尋較為合理的AOM及AOM/DSS給藥的誘導方案，為研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的化學誘導模型建立提供動物實驗的比較數(shù)據(jù)，使研究者在根據(jù)自己的研究需要選擇結(jié)腸癌化學誘導方案時有可循的科學研究基礎(chǔ)，推動結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的科學研究進展[9-10]。

材料與方法

一、主要試劑和動物

AOM(Sigma公司，美國)，DSS(分子量36000 -50000，MP Biomedicals公司，美國)。SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，4周齡，256只。小鼠均由中山大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心，實驗室環(huán)境溫度為(23±3)℃，相對濕度為(55±15)%，晝夜明暗交替時間為12 h/12 h。小鼠進行普通飲食，每3 d更換墊料，水和食物隨時供應(yīng)，飼料與墊料均由中山大學實驗動物中心提供。所有有關(guān)動物的實驗過程均在中山大學實驗動物倫理委員會的監(jiān)督指導下完成，符合實驗動物倫理學要求。

二、主要方法

1.造模及分組

小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周(W)后，隨機分別單獨給予AOM或予AOM聯(lián)合DSS誘導結(jié)腸癌。

對于單獨給予AOM處理的小鼠，隨機分成4組(低AOM、中AOM、高AOM及AOM對照組)，每組24只，于W1、W2、W3、W4分別給予低、中、高濃度AOM(10 mg/kg、15 mg/kg、20 mg/kg)皮下注射，同期小鼠皮下注射0.1 ml/10 g生理鹽水作為對照。每組分別于W5、W8、W11、W14隨機各處死6只小鼠。

對于AOM聯(lián)合DSS處理的小鼠，隨機分為4組(DSS1、DSS2、DSS3及DSS對照組)，小鼠于W1皮下注射10 mg/kg的AOM，1周后予2% DSS溶液自由飲用7 d，隨后予正常飲用水2周。每1周DSS與2周正常飲用水為1個循環(huán)周期，DSS1、2、3組小鼠分別予以循環(huán)1次、2次、3次，小鼠數(shù)量分別為50只、41只、29只。DSS對照組有40只小鼠，于W1皮下注射0.1 ml/10 g生理鹽水。DSS1組和DSS對照組分別于W5、W8、W11、W14隨機各處死10只小鼠；DSS2組分別于W8、W11、W14隨機各處死10只小鼠；DSS3組分別于W11、W14隨機各處死10只小鼠。

2.標本采集

小鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死，沿腹中線打開腹腔，剪取自回盲部至直腸的腸段，使用預(yù)冷的PBS清洗腸道，沿長軸打開腸腔，仔細觀察并觸摸腸腔表面有無腫瘤形成。若結(jié)直腸未見腫瘤形成，則進行ACF的計數(shù)；若發(fā)現(xiàn)腫瘤形成，則進行腫瘤的計數(shù)觀察。

3.ACF計數(shù)

將腸道攤平并夾在兩張濾紙之間，用2 g/L亞甲藍染色20 min。腸道黏膜面向上，用光學顯微鏡在40×或100×觀察條件下，計數(shù)每個完整結(jié)腸中ACF的數(shù)量。正常隱窩鏡下呈類圓形，大小均勻，分布規(guī)則。ACF鏡下可見多個隱窩的融合，較正常隱窩深染[5]。

4.腫瘤計數(shù)和病理觀察

觀察并記錄其腫瘤的數(shù)量、大小、位置，測量并記錄每個腫瘤的最長徑和垂直短徑。分別切取每個腫瘤及其癌旁組織和正常組織，4%多聚甲醛固定，進行石蠟包埋，制備組織切片，蘇木素-伊紅染色后，于光學顯微鏡下觀察。按下述公式計算腫瘤體積、腫瘤發(fā)生率、平均成瘤數(shù)量和荷瘤小鼠平均成瘤數(shù)量：腫瘤體積=(最長徑×垂直短徑2)/2；腫瘤發(fā)生率(%)=荷瘤小鼠數(shù)量/實驗小鼠數(shù)量×100%；平均成瘤數(shù)量=腫瘤數(shù)量/實驗小鼠數(shù)量；荷瘤小鼠平均成瘤數(shù)量=腫瘤數(shù)量/荷瘤小鼠數(shù)量。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、不同AOM濃度和不同DSS循環(huán)周期對小鼠死亡率的影響

低AOM組、中AOM組、高AOM組及AOM對照組均無小鼠死亡。DSS1組共有10只小鼠死亡，死亡率為20.00%；DSS2組共有11只小鼠死亡，死亡率為26.83%；DSS3組共有9只小鼠死亡，死亡率為31.03%；DSS對照組未見小鼠死亡。然而，AOM暴露濃度的增高和DSS循環(huán)周期的增加對小鼠的死亡率增長的影響并無統(tǒng)計學意義(P>均0.05)。

二、不同AOM濃度和暴露時間對小鼠ACF形成的影響

同一暴露時間下，隨著AOM濃度的增加，小鼠結(jié)腸ACF的平均數(shù)量增加(P均<0.05，表1)；同一暴露濃度下，隨著AOM暴露時間的增加，小鼠結(jié)腸ACF的平均數(shù)量也可見增加(P均<0.001，表1)。在開始AOM暴露的4周時，異常隱窩在鏡下主要表現(xiàn)為單個隱窩的變化，可見隱窩體積增大，腺細胞膜增厚、染色加深(圖1A)；隨著暴露時間的增加，ACF的隱窩數(shù)量和體積均有所增加增大(圖1B)。

表1 不同濃度AOM處理組小鼠結(jié)腸ACF的數(shù)量 個

圖1 小鼠結(jié)腸ACF的亞甲基藍染色

A：箭頭所示為中AOM組(15 mg/kg)W5時小鼠結(jié)腸形成的一個ACF，由單個隱窩構(gòu)成，體積較正常隱窩增大，染色加深(×100)；B：箭頭所示為中AOM組(15 mg/kg)W14時小鼠結(jié)腸形成的一個ACF，由多個隱窩融合構(gòu)成，染色加深，體積明顯增大(×40)

三、不同DSS循環(huán)周期對小鼠結(jié)腸腫瘤形成的影響

顯微鏡下觀察，腫瘤為腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變。與正常對照組相比，可見腺體排列紊亂、腺細胞大小不一、核大深染、核型不規(guī)則、病理性核分裂像等(圖2)。

圖2 AOM/DSS處理組中正常結(jié)腸組織和腫瘤組織的蘇木素-伊紅染色

A：正常小鼠結(jié)腸由黏膜層、黏膜下層、固有肌層和漿膜層構(gòu)成。腸腺呈長管狀，可見大量空泡狀的杯狀細胞(×40)；B：腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變。腫瘤呈外生性生長，腺體擁擠、排列紊亂，杯狀細胞比例較正常減少。腫瘤腔面呈高級別上皮內(nèi)瘤變改變，腺體更為擁擠紊亂，部分腺體喪失圓管狀排列，呈不規(guī)則型。腫瘤邊界清楚，未侵及黏膜肌層(×40)；C：腺體排列紊亂，細胞異型伴核深染(×100)；D：左側(cè)腺體仍保持管狀形態(tài)，由單層細胞構(gòu)成，杯狀細胞比例較正常腺體減低，細胞核大小較均一，未見病理性核分裂；右側(cè)腺體喪失管狀形態(tài)，腺體部分區(qū)域由多層細胞構(gòu)成，未見正常的杯狀細胞，細胞核較左側(cè)腺體染色更深，細胞核大小不均，可見病理性核分裂現(xiàn)象(×400)

AOM聯(lián)合DSS可使小鼠結(jié)腸形成腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變，相比DSS一循環(huán)，DSS二、三循環(huán)可顯著增加腫瘤發(fā)生率、平均成瘤數(shù)量、荷瘤小鼠平均成瘤數(shù)量及腫瘤體積(P<0.05或0.008)，見表2。

表2 不同DSS循環(huán)周期對小鼠腫瘤形成的影響

續(xù)表

組 別處理周數(shù)n帶瘤鼠數(shù)腫瘤發(fā)生率(%)腫瘤個數(shù)平均成瘤數(shù)量(個/只)荷瘤小鼠平均成瘤數(shù)量(個/只)腫瘤體積(mm3)W81000.000000W111000.00eg00eg0df0W141000.00eg00eg0df0

注：與本組W8比較，aP<0.017；與DSS1組比較，bP<0.05,cP<0.008；與DSS2組比較，dP<0.05,eP<0.008；與DSS3組比較，fP<0.05,gP<0.008

討 論

AOM作為一種常用的結(jié)腸癌建模藥物，可通過引起鳥嘌呤甲基化誘導突變損傷，促進嚙齒類動物結(jié)腸癌模型的形成，其成癌過程也符合人類結(jié)腸癌80%發(fā)病的機制，即“正常腸黏膜-ACF-腺瘤-腺癌”的動態(tài)變化過程[1，10-13]。在使用AOM的基礎(chǔ)上加用DSS，可在化學藥物致癌的基礎(chǔ)上，重復誘導腸道上皮損傷與修復的慢性炎癥狀態(tài)，形成炎癥相關(guān)性結(jié)腸癌模型，更可增加小鼠模型的成瘤效率，減少腫瘤形成時間[1,10,14-15]。由于目前文獻報道的AOM及AOM/DSS相關(guān)動物實驗采用不同的給藥濃度及實驗周期，對其實驗結(jié)果進行評價分析則相對困難，本實驗通過研究不同藥物濃度、給藥周期及暴露時間下，AOM和AOM聯(lián)合DSS對C57BL/6J小鼠腸癌成模效果/效率的影響，探尋較為合理的誘導方案，提供結(jié)腸癌化學誘導模型動物實驗的比較數(shù)據(jù)，在一定程度上為早期干預(yù)治療腸癌的研究提供了新的思路和標準，具有較大的實驗意義和價值[4,6-9]。

ACF目前被認為是結(jié)直腸癌成癌過程中可在光鏡下觀察到的最小、最早期的結(jié)腸黏膜上皮的癌前病變，其發(fā)生被認為和最終的結(jié)腸腫瘤發(fā)生有著密切的關(guān)系[16]。在亞甲藍染色的光鏡觀察下，ACF表現(xiàn)為腺管染色加深、面積增大；腺細胞上皮層增厚，細胞核的不典型增生現(xiàn)象[17]。AOM可通過誘導K-Ras、β-catenin等基因的突變誘發(fā)ACF形成，進而促進結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究顯示，小鼠腸道ACF的形成與注射的AOM劑量和總實驗時間密切相關(guān)。隨著AOM藥物濃度的增加，小鼠結(jié)腸ACF的平均數(shù)量明顯增加，提示在小鼠腸癌模型中，AOM既是腫瘤誘發(fā)劑，又起著腫瘤生長促進劑的作用。隨著實驗時間的增加，小鼠結(jié)腸ACF的平均數(shù)量顯著增加，光鏡下觀察到的ACF也由單個隱窩細胞的深染、上皮層增厚，變?yōu)槎鄠€異常隱窩融合形成的增生灶，揭示了腸道癌前病變隨著時間進展的發(fā)生發(fā)展情況。

DSS作為促炎劑，可抑制腸上皮細胞增生，影響細胞DNA合成，破壞腸黏膜屏障，導致巨噬細胞功能障礙及腸道菌群失調(diào)，反復誘導小鼠腸黏膜炎癥形成[15]。在AOM的基礎(chǔ)上聯(lián)合DSS建模，可影響APC、β-catenin、K-Ras、COX-2、iNOS等基因，促進隱窩細胞增生，改變隱窩細胞正常代謝和膽汁酸腸肝循環(huán)，破壞腸道菌群生長平衡，最終誘發(fā)腫瘤形成[9]。本研究顯示，AOM聯(lián)合DSS建立的C57BL/6J小鼠模型中，其結(jié)腸腫瘤的病理類型為腺瘤伴高級別上皮內(nèi)瘤變，病變尚未侵及黏膜下層，這或受實驗時間所限。在采用1次10 mg/kg的AOM皮下注射結(jié)合DSS2循環(huán)的實驗組中，W14的腫瘤發(fā)生率是W8的7倍；其平均成瘤數(shù)量是W8的14倍，平均成瘤數(shù)量的中位數(shù)也是W8的10倍，提示在該給藥方案下，增加實驗時間可有效增加成瘤效率。然而W11和W14的各項腫瘤評估指標未見統(tǒng)計學差異，這或提示在此方案下，小鼠腸癌模型存在誘導腫瘤生成的平臺狀態(tài)。

另外，在W11，DSS2或DSS3循環(huán)組較DSS1循環(huán)組的腫瘤發(fā)生率和荷瘤小鼠平均成瘤數(shù)量可見顯著增加，且DSS3循環(huán)組較DSS2循環(huán)組的腫瘤體積也有明顯增加，說明DSS循環(huán)周期的增加可顯著提高AOM聯(lián)合DSS方案的成瘤效果/效率。然而在W14，DSS3循環(huán)組較DSS2循環(huán)組未見上述指標的變化，這或提示與單獨使用AOM的方案相似，AOM/DSS方案也存在誘導腫瘤生成的平臺狀態(tài)，在該平臺狀態(tài)，腫瘤數(shù)量不再增加，而是表現(xiàn)為體積的增大。

在本次共計14周的實驗中，單獨使用AOM并未形成結(jié)腸腫瘤，相同時間下AOM聯(lián)合DSS則可誘發(fā)腫瘤生成，驗證了AOM/DSS方案可有效提高結(jié)腸癌動物模型的成瘤效能，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多因素、多步驟長期共同作用的結(jié)果，結(jié)腸的炎癥損傷可明顯提高致癌劑的致癌效率。此外，AOM各實驗組未見小鼠死亡，提示小鼠對AOM的耐受性良好；DSS各實驗組均有小鼠死亡，并主要發(fā)生在DSS飲水的一周內(nèi)，但死亡率并無統(tǒng)計學差異，這或受較小的樣本量所限。

綜上所述，我們探討了AOM或AOM聯(lián)合DSS不同藥物劑量、給藥周期及暴露時間對建立結(jié)腸癌誘導模型效果的差異。我們認為，以ACF為目的和判斷標準的AOM建模方案中，20 mg/kg AOM皮下注射，每周1次，共4周，W14中止實驗為成本效益較佳的方案。以腫瘤形成及其數(shù)量體積為判斷標準的AOM/DSS建模方案中，于W1對小鼠皮下注射1次10 mg/kg AOM，再分別于W2和W5給予2次持續(xù)7 d的2%DSS替換正常飲水后，于W11進行腸道取材，為成本效益較佳的實驗方案。