宋 莎，韓秀梅，鄭 偉，吳亞維

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹科學(xué)研究所，貴州貴陽(yáng)550006)

磷(P)是果樹重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是影響果樹生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)的限制因子［1－2］。中國(guó)南方土壤磷肥當(dāng)季利用率低，土壤條件較差，磷利用問題更為突出。果樹屬木本植物，迄今有關(guān)果樹磷脅迫的研究還遠(yuǎn)不如其他一年生作物深入，耐低磷果樹篩選與鑒定的相關(guān)報(bào)道很少，主要集中在磷吸收利用［3－4］以及耐低磷脅迫的果樹砧木和品種的篩選等［5－6］。蘋果主要采用嫁接繁殖，砧木是重要的種質(zhì)資源和生產(chǎn)資料，影響蘋果生長(zhǎng)、整齊度、產(chǎn)量、成熟期、抗病性及適應(yīng)性等方面，發(fā)掘耐低磷基因型蘋果砧木或磷利用效率高的蘋果砧木并加以利用，以克服土壤磷素缺乏問題，對(duì)蘋果增產(chǎn)以及地力維護(hù)都具有重要意義。貴州省的蘋果栽培工作在逐步發(fā)展，且省內(nèi)多個(gè)地區(qū)都有豐富的野生蘋果砧木種質(zhì)資源［7－8］，由于長(zhǎng)期的變異積累和環(huán)境選擇，存在豐富的遺傳多樣性，有可能發(fā)掘出優(yōu)異的蘋果砧木資源。

磷脅迫條件下，果樹與磷代謝相關(guān)的生理指標(biāo)會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。果樹葉片、根系及土壤中的酸性磷酸酶活性、根系分泌性酸性磷酸酶活性與供磷水平呈顯著負(fù)相關(guān)［9］，隨著供磷水平下降，不同果樹葉片和根系的酸性磷酸酶活性均增強(qiáng)，硝酸還原酶活性均下降［6］。很多研究者將低磷脅迫下植物酸性磷酸酶活性和根系有機(jī)酸分泌量作為評(píng)價(jià)植物耐低磷脅迫能力的重要生理指標(biāo)［10－12］。本研究將葉片葉綠素、丙二醛、脯氨酸含量及酸性磷酸酶活性作為評(píng)價(jià)蘋果砧木磷脅迫響應(yīng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)12份蘋果砧木資源在不同供磷水平下葉片的生理特性進(jìn)行探討，以期為發(fā)掘利用耐低磷蘋果砧木資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為黃果三葉海棠(Malus sieboldii Rehd.)、垂絲海棠(Malus halliana Koehne)、青砧 2 號(hào)(Qingzhen No.2)、毛山荊子［Malus mandshurica(Maxim.)Kom.］、青砧 1 號(hào)(Qingzhen No.1)、湖北海棠(Malushupehensis Rehd.)、八棱海棠［Malus micromalus(Carr.)Rehd］、平 邑 甜 茶 ［Malus hupehensis(Pamp.)Rehd.］、紅果三葉海棠(Malus sieboldii Rehd.)、花紅(Malus asiatica Nakai.)、麗江山荊子(Malus rockii Rehd.)、西府海棠(Malus micromalus.)12 種生長(zhǎng)基本一致的蘋果砧木實(shí)生苗，其中青砧1號(hào)、青砧2號(hào)、八棱海棠和平邑甜茶種子由煙臺(tái)果樹科學(xué)研究所提供，其余種子采自貴州省威寧縣。

本試驗(yàn)于2016年7月在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)大棚進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖，營(yíng)養(yǎng)液選用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，以KH2PO4為磷源，營(yíng)養(yǎng)液配制用分析純?cè)噭?，水為蒸餾水。對(duì)12種供試材料分別設(shè)3個(gè)供磷水平處理，3個(gè)處理中有效磷含量分別為45 mg/L(高磷水平)、25 mg/L(中磷水平)、5 mg/L(低磷水平)。按照KH2PO4不同設(shè)計(jì)水平，用KCl補(bǔ)充鉀元素，使得各處理鉀元素水平相同。

將不同蘋果砧木實(shí)生苗分別移栽至珍珠巖盆栽中，先用1/2完全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，再用不同濃度的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，每3 d澆灌營(yíng)養(yǎng)液1次，每次每盆100 mL;每7 d澆灌蒸餾水1次，每次每盆2 000 mL。培養(yǎng)第21天采集各試驗(yàn)材料第4～5張新梢中部成熟葉樣－80℃保存待測(cè)。

1.3 試驗(yàn)方法

葉綠素(Chl)含量測(cè)定采用96%乙醇提取法［13］，丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法［14］，脯氨酸(PRO)含量測(cè)定采用磺基水楊酸法，植物酸性磷酸酶(ACP)活性測(cè)定采用磷酸苯二鈉法。每個(gè)樣品每個(gè)指標(biāo)測(cè)定各3次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析均在WPSExcel 2016和SAS 9.1軟件進(jìn)行，多重比較采用SNK－q檢驗(yàn)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

隸屬函數(shù)分析［15］計(jì)算公式為 U(X)=(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)。式中，U(X)為隸屬函數(shù)值;X為蘋果砧木某一指標(biāo)的測(cè)定值;Xmax和Xmin為所有蘋果砧木某一指標(biāo)內(nèi)的最大值和最小值。如果蘋果砧木某一指標(biāo)綜合評(píng)判結(jié)果為負(fù)，則使用反隸屬函數(shù)進(jìn)行評(píng)定，U(X)=1－(X－Xmin)/(Xmax－Xmin)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供磷水平對(duì)蘋果砧木葉綠素含量的影響

由表1可看出，不同供磷水平下黃果三葉海棠、毛山荊子、青砧1號(hào)、八棱海棠、平邑甜茶、紅果三葉海棠和花紅等蘋果砧木葉綠素含量差異不顯著。在高磷水平時(shí)，垂絲海棠、青砧2號(hào)和麗江山荊子3種蘋果砧木的葉綠素含量比中磷時(shí)顯著降低，分別降低了 14.44%、4.86%和 16.69%;在低磷水平時(shí)，湖北海棠、麗江山荊子和西府海棠3種蘋果砧木的葉綠素含量比中磷水平顯著降低，分別降低了22.82%、21.26%和5.25%。毛山荊子和青砧1號(hào)在不同供磷水平下葉綠素含量均較高。

表1 不同供磷水平下12種蘋果砧木葉片的葉綠素含量

2.2 供磷水平對(duì)蘋果砧木丙二醛含量的影響

由表2可看出，不同供磷水平下黃果三葉海棠、青砧2號(hào)、湖北海棠、平邑甜茶、紅果三葉海棠和花紅等蘋果砧木丙二醛含量差異不顯著。在高供磷水平時(shí)，垂絲海棠、毛山荊子、青砧1號(hào)和八棱海棠丙二醛含量比中磷水平分別升高了89.25%、17.63%、11.99%和 77.01%，麗江山荊子和西府海棠丙二醛含量比中磷水平分別降低了44.68%和38.27%;在低供磷水平時(shí)，垂絲海棠、青砧1號(hào)、八棱海棠、西府海棠丙二醛含量比中磷時(shí)分別升高了 55.59%、33.33%、24.67% 和3.19%，毛山荊子、麗江山荊子丙二醛含量比中磷時(shí)分別降低了 15.79%和 39.85%。

表2 不同供磷水平下12種蘋果砧木葉片的丙二醛含量

2.3 供磷水平對(duì)蘋果砧木游離脯氨酸含量的影響

由表3可看出，供磷水平對(duì)蘋果砧木脯氨酸含量有明顯影響。在高供磷水平時(shí)，黃果三葉海棠、青砧2號(hào)和毛山荊子脯氨酸含量比中磷時(shí)分別降低了 13.30%、5.87%和11.21%，其余9種蘋果砧木脯氨酸含量均上升，上升幅度最大的是八棱海棠，升高了83.14%;在低供磷水平時(shí)，黃果三葉海棠、毛山荊子、紅果三葉海棠和麗江山荊子脯氨酸含量比中磷水平分別降低了 13.32%、34.86%、6.03%和20.96%，其余8種砧木脯氨酸含量均上升，西府海棠上升幅度最大，升高了 58.17%。

表3 不同供磷水平下12種蘋果砧木葉片的脯氨酸含量

2.4 供磷水平對(duì)蘋果砧木酸性磷酸酶活性的影響

由表4可看出，供磷水平對(duì)蘋果砧木葉片酸性磷酸酶活性有明顯影響。在高供磷水平時(shí)，黃果三葉海棠、垂絲海棠和青砧2號(hào)酸性磷酸酶活性比中磷時(shí)分別增強(qiáng)了190.68%、25.67%和41.51%，其余9種蘋果砧木酸性磷酸酶活性均下降，降幅最大的是青砧1號(hào)，降低了76.40%;在低供磷水平時(shí)，除八棱海棠、平邑甜茶、西府海棠酸性磷酸酶活性比重磷時(shí)增強(qiáng)，其余9種砧木酸性磷酸酶活性均下降，其中毛山荊子降幅最大，降低了90.59%。

2.5 蘋果砧木綜合評(píng)價(jià)

3個(gè)供磷水平下，葉綠素、丙二醛、脯氨酸含量及酸性磷酸酶活性4個(gè)生理指標(biāo)在不同蘋果砧木之間存在差異，單一指標(biāo)無法客觀評(píng)價(jià)蘋果砧木對(duì)磷脅迫的適應(yīng)性，因此采用隸屬函數(shù)法對(duì)不同供磷水平對(duì)不同蘋果砧木葉片生理特性的影響進(jìn)行分析。結(jié)果(表5)表明，與中磷水平相比，在高磷水平下排序上升的蘋果砧木有黃果三葉海棠、垂絲海棠、八棱海棠和紅果三葉海棠等;在低磷水平下排序上升的蘋果砧木有青砧2號(hào)、八棱海棠、平邑甜茶、紅果三葉海棠和西府海棠等。

表4 不同供磷水平下12種蘋果砧木葉片的酸性磷酸酶含量

表5 不同磷水平下蘋果砧木隸屬函數(shù)值及綜合評(píng)價(jià)結(jié)果

2.6 生理指標(biāo)間相關(guān)性分析

對(duì)不同供磷水平下12種蘋果砧木葉綠素、丙二醛、脯氨酸含量及酸性磷酸酶活性4個(gè)指標(biāo)之間進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果(表6)表明，不同供磷水平下不同蘋果砧木葉綠素含量和酸性磷酸酶活性之間相關(guān)系數(shù)最高，為0.93;葉綠素含量、丙二醛含量及酸性磷酸酶活性3個(gè)指標(biāo)間顯著正相關(guān)，而脯氨酸含量與其他3個(gè)指標(biāo)間相關(guān)性較低。

表6 4個(gè)生理指標(biāo)間的相關(guān)性

3 討論

磷素是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需元素之一。本試驗(yàn)結(jié)果表明，供磷水平對(duì)黃果三葉海棠、毛山荊子、青砧1號(hào)、八棱海棠、平邑甜茶、紅果三葉海棠和花紅等蘋果砧木葉片葉綠素含量的影響不顯著，其他蘋果砧木在高磷或低磷時(shí)葉綠素含量降低;供磷水平對(duì)黃果三葉海棠、青砧2號(hào)、湖北海棠、平邑甜茶、紅果三葉海棠和花紅等蘋果砧木葉片丙二醛含量影響不顯著，其他蘋果砧木在高磷或低磷時(shí)丙二醛含量多為升高，這可能是由于不同蘋果砧木葉片葉綠素和丙二醛含量受供磷水平影響的時(shí)段不同。大多蘋果砧木葉片在高磷或低磷時(shí)脯氨酸含量升高，對(duì)磷元素較敏感。而本試驗(yàn)中蘋果砧木葉片多在高磷或低磷時(shí)酸性磷酸酶活性下降;僅八棱海棠、平邑甜茶和西府海棠3種蘋果砧木酸性磷酸酶活性隨著供磷水平的下降而增強(qiáng)，與樊衛(wèi)國(guó)等的結(jié)論［6］一致，可能和測(cè)定樣品差異有關(guān)。

不同供磷水平對(duì)蘋果砧木生理特性的影響，是蘋果砧木對(duì)不同磷濃度適應(yīng)性強(qiáng)弱的反映。隸屬函數(shù)分析結(jié)果顯示，毛山荊子在高磷和中磷時(shí)均排在第1位，對(duì)高供磷水平不敏感，在正常條件下是生長(zhǎng)較好的蘋果砧木;低磷時(shí)平邑甜茶排在第1位，且本試驗(yàn)中平邑甜茶在低磷時(shí)酸性磷酸酶活性顯著較高，與季萌萌等報(bào)道的平邑甜茶根系發(fā)達(dá)，磷酸根離子親和性高，相對(duì)磷效率和磷吸收效率僅次于富平楸子結(jié)論［4］相一致，證實(shí)了平邑甜茶是比較耐低磷脅迫的蘋果砧木，為今后進(jìn)一步研究平邑甜茶耐低磷的分子機(jī)制和其作為耐低磷蘋果砧木加以利用提供了依據(jù)。垂絲海棠和花紅這2種蘋果砧木在不同供磷水平下排序都排在前幾位，可能對(duì)磷素敏感性較低。

磷在果樹光合作用過程中具有重要作用。葉綠體是細(xì)胞對(duì)磷最敏感的細(xì)胞器，不同供磷水平影響葉綠素含量［16］，丙二醛含量是抗性生理研究中最重要的指標(biāo)之一;脯氨酸積累是許多植物受到逆境脅迫的一種信號(hào)［17］;酸性磷酸酶是植物中活性高、分布廣的一種誘導(dǎo)酶，其活性受植物供磷水平影響，在植物磷代謝中起重要作用［18］。綜合考慮后選用這幾個(gè)生理生化指標(biāo)開展本次研究并對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，研究結(jié)果顯示，葉綠素、丙二醛含量以及酸性磷酸酶活性這3個(gè)指標(biāo)間顯著相關(guān)，可作為今后研究蘋果砧木磷脅迫響應(yīng)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。