蔡繼鴻，徐 鵬，張香桂，郭 琪，徐珍珍，沈新蓮

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花油菜重點實驗室，江蘇南京210014)

為適應(yīng)不良生長環(huán)境，植物在長期的進化過程中形成了一系列復(fù)雜而有效的應(yīng)對機制。現(xiàn)有的研究表明，這種由于自身進化而獲得的應(yīng)對機制主要是通過轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)基因的表達發(fā)生作用的。而在這一過程中，轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮重要作用，通過與其他相關(guān)蛋白或自身之間的相互作用激活或抑制相關(guān)靶基因的表達。近年來，研究顯示W(wǎng)RKY轉(zhuǎn)錄因子家族中眾多成員都參與植物的非生物脅迫響應(yīng)機制［1］，目前已經(jīng)成為植物抗性功能研究中的一個熱點。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為一個重要的轉(zhuǎn)錄因子超家族，除了參與植物的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝途徑及在抗病毒、細菌等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用外，還參與應(yīng)答環(huán)境信號刺激，如低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫逆境［2］。近年來，由于鹽堿化對我國農(nóng)業(yè)的影響，植物耐鹽機制的研究已成為熱點。目前很多研究都表明WRKY參與植物對鹽脅迫的響應(yīng)。在前期的研究中，基于鹽脅迫下旱地棉轉(zhuǎn)錄組測序，共鑒定了28個受鹽脅迫誘導(dǎo)的WRKY基因［3］。本研究對耐鹽陸地棉品種K368和鹽敏感品種蘇棉12號的28個耐鹽相關(guān)WRKY基因進行表達分析，為棉花耐鹽機制的研究提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為陸地棉品種K368和蘇棉12號(簡稱:蘇12)。將種子播于盆缽中，待長至2葉1心時開始鹽處理，將小苗浸在含 200 mmol/L NaCl(其中 Na+∶Ca2+濃度比為15 ∶1)的營養(yǎng)液中，分別處理 0、6、24、72 h，取不同時期的根液氮速凍后于－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 耐鹽鑒定

耐鹽鑒定試驗于2006年12月在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所培養(yǎng)室進行。將預(yù)發(fā)芽的K368和蘇12種子播于土質(zhì)盆砵中，將盆砵放于28℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長至2葉1心時開始鹽處理，鹽處理濃度為350 mmol/L。處理當天取10株幼苗作為對照，測定相關(guān)指標，包括植株高度、地上部生長量等。處理7 d后測定鹽脅迫下和清水對照的10株植株相關(guān)指標，計算植株相對高度、地上部相對生長量等。性狀相對值為脅迫環(huán)境下某性狀表型值與對照環(huán)境下某性狀表型值的比率，計算公式:某性狀相對值=某一性狀鹽脅迫時表型值/對照環(huán)境表型值。

1.3 實時熒光定量PCR

不同鹽處理時期根樣RNA提取參照文獻［4］。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為實時熒光定量PCR的模板，以棉花的Actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)WRKY基因的非保守區(qū)設(shè)計特異性引物，對WRKY基因進行熒光定量PCR擴增，檢測基因受鹽脅迫誘導(dǎo)時的表達情況。實時熒光定量PCR分析方法參照文獻［3］，數(shù)據(jù)分析通過 2－ΔΔCT公式計算基因的相對表達量［5］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下K368和蘇12表型比較

由圖1可知，與對照相比，經(jīng)350 mmol/L鹽處理7 d后，K368和蘇12均出現(xiàn)明顯的鹽害脅迫癥狀，生長均受到明顯抑制。與K368相比，蘇12在生長上受到的抑制更明顯。鹽處理7 d后測定相關(guān)指標來評價2個品種的耐鹽性，包括植株相對高度、相對地上部鮮質(zhì)量和相對地上部干質(zhì)量等。由表1可知，K368和蘇12相對株高、相對地上部鮮質(zhì)量、相對地上部干質(zhì)量差異極顯著。因此，認為K368相對于蘇12表現(xiàn)出更好的耐鹽性。

2.2 鹽脅迫下耐鹽相關(guān)WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12根部的表達分析

表1 鹽脅迫下K368和蘇棉12號表型比較

利用實時熒光定量PCR對耐鹽品種K368的28個耐鹽相關(guān)WRKY基因進行表達分析，由圖2可知，較之對照(鹽處理0 h)，27個WRKY基因在鹽處理不同時期(6、24、72 h)誘導(dǎo)表達中僅WRKY22表達差異不顯著。大部分耐鹽相關(guān)WRKY基因隨著鹽處理時間延長，其相對表達量表現(xiàn)為逐步上升的趨勢，且大部分WRKY基因在鹽處理24 h后其相對表達量達到最高，其中WRKY5、WRKY6以及WRKY38在鹽處理24 h后其相對表達量上調(diào)300倍以上;僅WRKY107隨著鹽處理時間延長，其相對表達量表現(xiàn)為逐步下調(diào)趨勢。

本研究同樣對鹽敏感品種蘇12的28個WRKY基因進行了表達分析，由圖3可知，25個WRKY基因鹽脅迫誘導(dǎo)表達中僅WRKY9、WRKY75、WRKY105表達差異不顯著。大部分WRKY基因鹽脅迫后其相對表達量表現(xiàn)為上調(diào)表達，其中WRKY31在鹽處理24 h后上調(diào)表達800倍以上;僅WRKY22、WRKY52、WRKY90鹽處理后表現(xiàn)為下調(diào)表達。

2.3 耐鹽相關(guān)WRKY基因在K368和蘇12中差異表達分析

本研究分別對28個WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12中進行了差異表達分析，其中22個WRKY基因在品種間表達趨勢表現(xiàn)一致，即鹽處理后WRKY基因在K368和蘇12較之對照均表現(xiàn)為上調(diào)表達或下調(diào)表達，僅僅在表達量上存在差異。其中12個WRKY基因在耐鹽品種K368中相對表達量更高，如WRKY6在耐鹽品種K368中鹽處理24 h后其相對表達量達到了300倍以上，在鹽敏感品種蘇12中，其相對表達量在鹽處理72 h后最高，與對照相比較，其表達量僅上調(diào)了6倍。5個WRKY基因在鹽敏感品種蘇12中相對表達量更高，如WRKY43在蘇12中其相對表達量在鹽處理24 h達到約600倍，而在耐鹽品種K368中，其相對表達量在鹽處理24 h后僅上調(diào)了不到10倍。5個WRKY基因在K368和蘇12中表達量相當，無明顯差異。此外，有6個WRKY基因在K368和蘇12中表達不一致，WRKY52、WRKY90鹽處理后在K368中表現(xiàn)為上調(diào)表達，而在蘇12中則表現(xiàn)為下調(diào)表達;WRKY9、WRKY75、WRKY105鹽處理后在K368中表現(xiàn)為上調(diào)表達，而在蘇12中差異表達不顯著;WRKY22鹽處理后在蘇12中表現(xiàn)下調(diào)表達，而在K368中差異表達不顯著。綜上所述，鹽脅迫后總共有23個WRKY基因在耐鹽品種K368和鹽敏感品種蘇12中差異表達，僅 WRKY5、WRKY27、WRKY28、WRKY51 及WRKY104無明顯差異。推測該23個WRKY基因可能與陸地棉耐鹽性有一定的關(guān)聯(lián)。

3 討論與結(jié)論

許多研究已報道了WRKY基因可能參與鹽脅迫誘導(dǎo)表達，在植物中過量表達一些WRKY基因能夠改良植物的耐鹽能力。在擬南芥中，35個WRKY基因中有18個基因被鹽脅迫誘導(dǎo)表達，過量表達WRKY25、WRKY33可明顯提高擬南芥的耐鹽性［6］。Qiu等研究發(fā)現(xiàn)，水稻的13個WRKY基因中有9個應(yīng)答NaCl處理，過量表達OsWRKY45可提高擬南芥的耐鹽性［7］。大豆中64個WRKY轉(zhuǎn)錄因子中的22個在鹽脅迫下差異表達，過量表達大豆GmWRKY54可提高擬南芥的耐鹽性［8］。過量表達玉米ZmWRKY33可改善擬南芥的耐鹽性［9］。這些都說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員是響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)的重要調(diào)控因子。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上繼續(xù)對受鹽脅迫誘導(dǎo)的28個WRKY基因在陸地棉中進行表達分析，大部分WRKY基因均表現(xiàn)為不同程度的誘導(dǎo)表達，推測可能與陸地棉耐鹽特性有一定關(guān)聯(lián)性，但是表達強度的差異是否影響到基因功能，對此還需要進一步研究。

目前，棉花中已經(jīng)有很多關(guān)于WRKY響應(yīng)鹽脅迫反應(yīng)報道。Shi等從陸地棉中分離出GhWRKY39，該基因被病原菌以及鹽脅迫誘導(dǎo)，在擬南芥中過量表達該基因能夠提高其耐鹽性［10］。Zhou等從陸地棉中鑒定了26個WRKY基因，在NaCl誘導(dǎo)下其中的5個基因在根中上調(diào)表達［11］。Cai等在全基因組范圍內(nèi)分析雷蒙德氏棉WRKY基因家族，同時也在陸地棉中分析了這些基因在非生物脅迫下的表達情況［12－13］。所有這些結(jié)果表明WRKY基因參與了棉花對鹽脅迫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的應(yīng)答。