吳家鑫，劉敏，尚飛，宋敏，張傳良，張剛，徐金雷，齊鵬，肖進，郭麗清

(1.中牧實業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學藥品重點實驗室/北京市獸用多肽疫苗設計與制備工程技術(shù)研究中心，北京 100095；2.北京化工大學生命科學與技術(shù)學院/北京市生物加工過程重點實驗室，北京 100029；3.北京化工大學分析測試中心，北京 100029)

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素( Macrolide antibiotics) 是一類具有大環(huán)內(nèi)酯環(huán)這種基本化學結(jié)構(gòu)和相似抗菌譜的弱堿性抗菌化合物[1]，通常為14～16元環(huán)，在大環(huán)上通過羥基，以苷鍵與1～ 3個去氧氨基糖或二甲氨基糖縮合成堿性苷[2]，其對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體屬、衣原體屬等病原體都具有較強的抑制能力，廣泛應用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)[3-5]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素通過干擾細菌蛋白質(zhì)的合成起到抑菌和殺菌作用[6-7]。在蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄過程中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素與50s核糖體亞基實現(xiàn)可逆結(jié)合，從而阻止肽鏈延伸[8-9]。由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在畜牧業(yè)中的大量使用，因此，建立一種快速篩選鑒別動物體內(nèi)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法具有重要意義。超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)具有超高壓、超高靈密度、超高分離度等特點[10-11]。高分辨四級桿飛行時間質(zhì)譜(Q-TOF-MS)具有選擇性高、受基質(zhì)干擾小、方法建立過程簡單等特點[12]，可以同時獲取母離子及其二級質(zhì)譜碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，準確推算可能的分子式，從而對化合物的結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律加以確證[13-15]。超高效液相色譜-高分辨率四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOP-MS)不僅可以有效提高抗生素快速定性篩查的可靠性，還可以獲得較高靈敏度的定量結(jié)果[16-18]。

本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜，同時檢測豬血漿中常見大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的母離子及其二級質(zhì)譜分析碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間，建立數(shù)據(jù)庫，快速篩查鑒別豬血漿中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。本方法實用性強，后期可對數(shù)據(jù)庫進行擴充，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的快速篩查鑒別具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 Agilent 7890B超高效液相色譜儀，配備二元梯度泵，真空在線脫氣機，自動進樣器，Agilent 6540Q-TOF質(zhì)譜儀；儀器控制、數(shù)據(jù)采集軟件及數(shù)據(jù)分析軟件采用Agilent公司的Mass Hunter系統(tǒng)。

螺旋霉素，Dr Ehrenstorfer GmbH；麥迪霉素，中國藥品生物制品檢定所；地紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素、阿奇霉素、克拉霉素，中國食品藥品檢定研究院；紅霉素、替米考星、泰樂菌素、吉他霉素，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；泰萬菌素、泰地羅新、加米霉素、泰拉霉素，中牧實業(yè)股份有限公司自制對照品(經(jīng)核磁鑒定)；甲酸， Fisher公司，色譜純；乙腈，F(xiàn)isher公司，質(zhì)譜純。

1.2 超高效液相色譜-高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜檢測方法 超高效液相色譜條件：Agilent Extend-C18色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫40 ℃。流動相：A相為0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸銨)，B相為乙腈；流速0.4 mL/min。進樣體積為3 μL；梯度洗脫程序：0.00→1.00 min，95%→95%A；1.00→10.00 min，95%→50%A；10.00→10.10 min，50%→95%A；10.10→13.00 min，95%→95%A。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子源(ESI+)，電壓3500 V， 干燥氣溫度 300 ℃, 錐孔電壓65 V，鞘氣溫度350 ℃，干燥氣和鞘氣流量分別為8、11 L/min，霧化氣壓力35 psi，全掃描模式(10～2000 amu)。

1.3 溶液配制

1.3.1 對照品溶液的配制 取上述各抗生素對照品適量，利用甲醇將其溶解。再將各抗生素甲醇溶液混合制成抗生素對照品儲備溶液。

1.3.2 樣品溶液的制備 準確稱量2.50 g豬血漿，加入甲醇稀釋定容至5.00 mL，漩渦振蕩30 s，待混合均勻后超聲提取15 min，14000 r/min 離心10 min，取上層清液，過0.45 μm有機濾膜到進樣瓶中，供檢測使用。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC-Q-TOF-MS檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素數(shù)據(jù)庫的建立 數(shù)據(jù)庫收錄了常見的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的(共計26 種化合物)相關(guān)信息,包括大環(huán)內(nèi)酯類抗生素類化合物的分子式、精確相對分子質(zhì)量數(shù)、準分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、主要碎片峰的精確質(zhì)量數(shù)和保留時間(表1)。

表1 26種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素類化合物的分子式、精確相對分子質(zhì)量數(shù)、準分子離子峰精確質(zhì)量數(shù)、保留時間以及主要碎片峰的精確質(zhì)量數(shù)Tab 1 Formula、accurate mass、accurate-mass of quasi-molecular ion, retention time and accurate-mass of main fragment ion of 26 common macrolide antibiotics

續(xù)表

交沙霉素二級質(zhì)譜電壓為35 V，其余二級質(zhì)譜電壓為40 V

2.2 豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素精確質(zhì)量數(shù)快速篩查及初步鑒別 本研究建立了多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素精確質(zhì)量數(shù)的數(shù)據(jù)庫。通過對UPLC-Q-TOF-MS分析得到的精確質(zhì)量數(shù)對豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行快速篩查。高分辨質(zhì)譜可以在全掃描模式下以較小的離子窗口提取離子，從而有效降低背景噪音，提高信噪比[19]。本研究以±25 mDa為質(zhì)量窗口，以[M+H]+為目標離子進行豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的篩選。

對一份豬血漿樣品進行UPLC-Q-TOF-MS分析，獲得正離子模式總離子流圖，然后通過數(shù)據(jù)庫的泰地羅新和紅霉素精確相對分子質(zhì)量對總離子流圖進行信號提取，以±25 mDa為質(zhì)量窗口信號(分別為m/z734.50～734.55和m/z734.45～734.45)提取得到圖1～圖3。圖1中有明顯的提取離子流峰，保留時間為2.598 min，其對應[M+H]+峰為m/z734.5327(圖2)，以Mass hunter軟件進行匹配度分析，泰地羅新的實際測量值與理論計算值匹配良好。圖3中有明顯的提取離子流峰，保留時間為5.952 min，其對應[M+H]+峰為m/z734.4705(圖4)，以Mass hunter軟件匹配度分析，紅霉素的實際測量值與理論計算值匹配良好。由此可見UPLC-Q-TOF-MS通過選取較小的離子窗口提取離子，可以將相對分子質(zhì)量較為接近的物質(zhì)進行區(qū)分。以上結(jié)果可以看出，通過高分辨質(zhì)譜對精確質(zhì)量數(shù)進行分析，可以完成對豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的快速篩查及初步鑒定。

圖1 泰地羅新提取離子流譜圖Fig 1 Extracted ion flow chart of Tildipirosin

圖2 泰地羅新一級質(zhì)譜質(zhì)譜圖Fig 2 MS mass chromatogram of Tildipirosin

圖3 紅霉素提取離子流譜圖Fig 3 Extracted ion flow chart of Erythromycin

圖4 紅霉素一級質(zhì)譜質(zhì)譜圖Fig 4 MS mass chromatogram of Erythromycin

2.3 通過保留時間及二級質(zhì)譜碎片分析進行確認鑒別 UPLC-Q-TOF-MS通過對精確質(zhì)量數(shù)篩選，實現(xiàn)了對豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的初步篩查鑒定，在此基礎上可以使用標準品通過保留時間進一步確認。但是，某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素具有多個組分，例如吉他霉素具有11個組分[20]，缺少單一組分的標準品。甚至某些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素存在組分之間的相互轉(zhuǎn)化[21]，例如泰拉霉素，同樣缺少單一組分的標準品。對于這些缺少標準品的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素可以通過二級質(zhì)譜分析獲得化合物的碎片信息進行確認鑒別。UPLC-Q-TOF-MS可以同時獲取整個色譜分離階段的每個可檢測峰中的所有母離子及其二級質(zhì)譜碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間，配合數(shù)據(jù)軟件的高通量數(shù)據(jù)分析，可以有效簡化化合物的篩查和確證過程[19]。對于已經(jīng)篩選到的兩種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，通過保留時間的對比進一步確定為泰地羅新和紅霉素。在正離子模式下對這兩個化合物進行了二級質(zhì)譜分析，其二級質(zhì)譜特征碎片離子存在明顯的差異，泰地羅新二級質(zhì)譜圖(圖5)中的碎片按照豐度由高到低為m/z98.0968、174.1125和132.1020，而紅霉素二級質(zhì)譜圖(圖6)中的碎片按照豐度由高到低為m/z158.1175、83.0491和116.1068，由此可見通過二級質(zhì)譜分析在沒有標準品的條件下也可以對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素進行進一步鑒別和區(qū)分。

圖5 泰地羅新二級質(zhì)譜質(zhì)譜圖Fig 5 MS/MS mass chromatogram of Tildipirosin

圖6 紅霉素二級質(zhì)譜質(zhì)譜圖Fig 6 MS/MS mass chromatogram of Erythromycin

2.4 重復性及靈敏度 在最佳儀器條件下，以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的提取離子流峰面積為考察指標，對UPLC-Q-TOF-MS方法的重復性進行了驗證。重復進樣6次，結(jié)果表明，提取離子流峰面積的RSD值均低于5. 53%；保留時間的RSD值均低于4.82%，說明該方法的重復性良好。由于吉他霉素的11種組分缺少相應標準品，泰拉霉素的2種組分存在相互轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，因此，只能對剩余的13種抗生素進行檢測限分析。以信噪比S/N=3為檢測限(LOD)，剩余13種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測限在1.00～8.00 ng/g范圍內(nèi)(表2)，該方法可以滿足豬血漿中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素快速篩選的需要。

表2 13種抗生素檢測限Tab 2 Limit of detection(LOD) of 13 macrolide antibiotics

3 結(jié) 論

本研究利用超高效液相色譜串聯(lián)高分辨四極桿飛行時間質(zhì)譜同時獲取豬血漿中常見大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的母離子及其二級質(zhì)譜分析碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)、保留時間三種信息，建立相關(guān)數(shù)據(jù)庫，快速篩查鑒別豬血漿中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。隨著獸藥科學的不斷發(fā)展，新的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素會不斷涌現(xiàn)，因此，本研究建立的豬血漿的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素數(shù)據(jù)庫需要逐步進行補充，以滿足今后檢測的實際需求。