范學(xué)政，馬健，陶慶樹，刁有江*

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，濟(jì)南 25000)

雞大腸桿菌病是由某些致病性大腸桿菌引起的雞的傳染病的總稱[1]。雞大腸桿菌感染是規(guī)?；曫B(yǎng)場的常見病，是引起肉雞細(xì)菌性感染的主要致病因素。近年來，隨著抗生素的大量使用，大腸桿菌對傳統(tǒng)抗菌藥的耐藥現(xiàn)象和抗菌藥物殘留問題日漸嚴(yán)峻，促使人們尋找抗生素的替代品[2]?？刮⑸锾烊划a(chǎn)物以其來源廣泛、不易產(chǎn)生耐藥性和綠色安全等特點(diǎn)而備受關(guān)注?？咕氖且活惥哂锌咕钚缘男滦涂咕?，一般由幾十個(gè)氨基酸殘基組成，不僅具有廣譜的抗菌作用，而且不易產(chǎn)生耐藥性，是抗生素的理想替代品[3]。P10B抗菌肽是針對大腸桿菌篩選得到的一個(gè)肽類先導(dǎo)化合物，初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌具有良好的抗菌作用。小檗堿是黃連、黃柏中的主要抗菌活性成分，常用來治療細(xì)菌性腸炎[4]。與臨床常用的鹽酸小檗堿相比，硫酸小檗堿的研究文獻(xiàn)較少，小檗堿硫酸鹽水溶性較高，更適合制成水溶性制劑，方便臨床應(yīng)用。本文擬通過對P10B抗菌短肽和硫酸小檗堿對大腸桿菌的體外聯(lián)合抗菌作用進(jìn)行研究，評價(jià)兩種抗菌藥的聯(lián)合用藥效果，以期為獸醫(yī)臨床新型復(fù)方抗菌制劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材 料

1.1 供試藥品 抗菌肽P10B，氨基酸序列為QKRPRVRLSA，分子量為1210.46，含量95%，樣品編號CL-2482，由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；硫酸小檗堿，含量95%，批號20170306，由濟(jì)南美事達(dá)獸藥有限公司提供；硫酸慶大霉素，含量為630 IU/mg，批號130326-201015，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 受試菌株 大腸桿菌肉雞源臨床分離株20株，由山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 質(zhì)控菌株 大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922，購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 培養(yǎng)基和試劑 MH肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購自杭州天和微生物試劑有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈣、氯化鈉等試劑購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。各種培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行配制，其中MH肉湯按正常使用濃度的單倍和雙倍兩種規(guī)格配制成陽離子調(diào)節(jié)的MH肉湯培養(yǎng)基[6]。

2 方 法

2.1 藥物儲備液的配制及保存 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，稱取適量硫酸小檗堿，加入滅菌蒸餾水，制成濃度為4096 μg/mL 的硫酸小檗堿溶液；稱取適量P10B抗菌肽，加入滅菌蒸餾水，制成濃度為5120 μg/mL的P10B抗菌肽溶液；兩種溶液分別用0.22 μm濾膜過濾除菌，制成抗菌儲備液。抗菌儲備液無菌分裝后，置于-20 ℃冰箱保存，備用。慶大霉素，用滅菌蒸餾水溶解，得到濃度為1280 IU/mL的慶大霉素抗菌儲備液。

2.2 菌懸液的制備 取純化的大腸桿菌單個(gè)菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)接到單倍MH肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取待測菌0.5 mL，裝入測試管，在600 nm波長下測定菌液OD值。以單倍MH肉湯為對照，用單倍MH肉湯調(diào)整OD值為0.08～0.1，得到濃度約為108CFU/mL的菌懸液[7]，再用單倍MH肉湯將待測菌濃度調(diào)整為1×106CFU/mL，備用。

2.3 單個(gè)抗菌藥對大腸桿菌的最小抑制濃度(MIC)的確定 參考CLSI抗菌藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[6]，采用微量肉湯稀釋法對大腸桿菌分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測，并以大腸桿菌ATCC25922為質(zhì)控菌株，CLSI質(zhì)控參數(shù)中沒有給出硫酸小檗堿的判定標(biāo)準(zhǔn)，在此以慶大霉素作為質(zhì)控用藥。每個(gè)測試單元體系為200 μL，其中包括抗菌藥測試液50 μL、雙倍MH肉湯50 μL、菌懸液100 μL。硫酸小檗堿、P10B、慶大霉素的最高測試液濃度分別為1024 μg/mL、128 μg/mL和32 IU/mL。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，各藥測試液濃度，以兩倍的級差遞減，得到10個(gè)濃度梯度。

取滅菌96孔U型板，無菌條件下，每排第一孔分別加入抗菌藥工作液100 μL，硫酸小檗堿、P10B、慶大霉素的工作液濃度分別為4096 μg/mL、512 μg/mL和128 IU/mL。然后，在每排第二孔至第十孔，分別加入滅菌蒸餾水50 μL。從第一孔吸取藥液50 μL，加至第二孔，吹打混勻后，從第二孔吸取混和液50 μL，加至第三孔，依次倍比稀釋至第十孔，從第十孔中吸取50 μL棄去。從第一孔到第十孔，分別加入2倍MH肉湯培養(yǎng)基50 μL，在第十一孔加入單倍MH肉湯培養(yǎng)基200 μL。從第一孔到第十孔，分別加入已經(jīng)調(diào)整濃度的菌懸液100 μL，在第十二孔加菌懸液和單倍MH肉湯各100 μL。密封96孔板，震蕩混勻后，置37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h后觀察并記錄結(jié)果。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，同時(shí)設(shè)立質(zhì)控菌ATCC25922對照。

2.4 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 根據(jù)單藥MIC試驗(yàn)結(jié)果，按2倍逐級遞減，以MH肉湯為稀釋液，分別制備4×MIC～1/16 ×MIC 7種工作濃度的硫酸小檗堿和P10B抗菌液，將兩藥各濃度組成7×7方陣，聯(lián)合用藥。取滅菌96孔板，沿縱列，濃度由低至高，分別從第七列至第一列加入硫酸小檗堿抗菌液，每孔各加50 μL；沿橫排，濃度由低到高，分別從第七排至第一排加入P10B抗菌液，每孔各加50 μL[8]。7×7方陣中每孔各加菌液100 μL?？v向第八列，從上至下，7孔只加單倍肉湯200 μL作為空白對照；橫向第八排，從左向右，7孔各加菌液和單倍肉湯100 μL，作為菌液生長對照。將96孔板密封，震蕩混勻后，置37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h后觀察并記錄結(jié)果。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)三次，同時(shí)設(shè)立質(zhì)控菌ATCC25922對照。

2.5 結(jié)果判定

2.5.1 MIC結(jié)果判定 當(dāng)質(zhì)控菌大腸桿菌ATCC25922的測試參數(shù)最低抑菌濃度在質(zhì)控范圍內(nèi)時(shí)，肉眼觀察能完全抑制孔內(nèi)大腸桿菌生長的最小的抗菌藥物濃度，即為該藥的MIC[7]。當(dāng)出現(xiàn)跳孔時(shí)，按參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行處理。

2.5.2 分級抑菌濃度(FIC)指數(shù)的結(jié)果判定[9]FIC指數(shù)=MIC小檗堿聯(lián)合/MIC小檗堿單用+MICP10B聯(lián)合/MICP10B單用，當(dāng)FIC指數(shù)≤0.5判為協(xié)同作用；當(dāng)該指數(shù)為0.5～1，判為相加作用；當(dāng)該指數(shù)為1～2 判為無關(guān)作用；當(dāng)該指數(shù)>2，判為拮抗作用。

3 結(jié)果與分析

3.1 單個(gè)抗菌藥對大腸桿菌的藥敏試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示，硫酸小檗堿對不同大腸桿菌臨床分離株的MIC范圍為128～1024 μg/mL，以MIC 512 μg/mL居多，MIC平均值為531.2 μg/mL。P10B對不同大腸桿菌臨床分離株的MIC范圍為8～32 μg/mL，以MIC 16 μg/mL居多，MIC平均值為17.2 μg/mL。質(zhì)控菌ATCC25922的測定結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，說明藥物敏感性檢測結(jié)果可靠。

3.2 聯(lián)合用藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果 硫酸小檗堿與抗菌肽P10B對大腸桿菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。在聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中，兩藥聯(lián)用呈協(xié)同作用的占10%，呈相加作用的占85%，呈無關(guān)作用的占5%。平均分級抑菌濃度指數(shù)為0.825，說明兩種藥聯(lián)用時(shí)，藥物效應(yīng)主要表現(xiàn)為累加作用。質(zhì)控菌ATCC25922的測定結(jié)果在質(zhì)控范圍內(nèi)，說明藥物敏感性檢測結(jié)果可靠。

4 討 論

本研究以臨床分離的肉雞源大腸桿菌為抑制對象，檢測了植物源抗菌藥物硫酸小檗堿與抗菌肽先導(dǎo)化合物P10B單用時(shí)的MIC及聯(lián)合使用時(shí)的FIC指數(shù)。

硫酸小檗堿對大腸桿菌臨床分離株的MIC以512 μg/mL為主，說明硫酸小檗堿對大腸桿菌的抗菌作用為抑菌作用。這與袁敏等對鹽酸小檗堿的檢測結(jié)果相吻合[10]。小檗堿是來源于植物的異喹啉類生物堿。在自然界中，天然產(chǎn)物往往對革蘭氏陽性菌的抗菌作用明顯。魏常志等研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對金黃色葡萄球菌的抗菌強(qiáng)度最高[11]。硫酸小檗堿對大腸桿菌臨床分離株的MIC值較高，這可能與大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的外部結(jié)構(gòu)有關(guān)，小檗堿的脂溶性較差，從而導(dǎo)致小檗堿不易進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)[12]。小檗堿口服吸收差，對大腸桿菌腸毒素引起的分泌性腹瀉具有良好的治療作用[13]。在獸醫(yī)臨床上，硫酸小檗堿更適合開發(fā)為治療腸道感染的藥物。

抗菌肽先導(dǎo)化合物P10B對大腸桿菌臨床分離株的MIC以16 μg/mL為主，初步顯示了對禽源致病性大腸桿菌良好的抗菌作用。提示P10B具有開發(fā)為新型抗大腸桿菌感染藥物的潛力。抗菌肽是生物體內(nèi)廣泛存在的抗菌活性物質(zhì)，不易產(chǎn)生耐藥性，在細(xì)菌耐藥和多重耐藥問題日益嚴(yán)峻的今天，抗菌肽已成為獸醫(yī)臨床上抵抗細(xì)菌性感染的重要的潛在候選藥物[14]。在硫酸小檗堿與P10B對大腸桿菌的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中，平均分級抑菌濃度指數(shù)為0.825，說明兩種藥在體外聯(lián)用時(shí)藥效增強(qiáng)，主要表現(xiàn)為累加作用。兩藥聯(lián)用時(shí)的MIC均有不同程度的下降，無拮抗現(xiàn)象，提高了抗菌效能。有益的聯(lián)合用藥可以增強(qiáng)藥物效應(yīng)，提高臨床療效，降低副作用，延緩耐藥性的產(chǎn)生[15]。本試驗(yàn)的檢測結(jié)果提示，在臨床上解決禽大腸桿菌腸道感染時(shí)，硫酸小檗堿與P10B組合可能是一種有效的聯(lián)合用藥方式。

表1 硫酸小檗堿與P10B單用和聯(lián)用時(shí)對大腸桿菌的體外抗菌作用結(jié)果Tab 1 The antibacterial effects in vitro of berberine sulfate combined with antibacterial peptide P10B against E.coli

*MIC單位：μg/mL

5 結(jié) 論

硫酸小檗堿對肉雞源大腸桿菌的抗菌作用，主要為抑菌作用；P10B對肉雞源大腸桿菌的抗菌作用較強(qiáng)。P10B抗菌肽與硫酸小檗堿聯(lián)合用藥對肉雞源大腸桿菌的抗菌效應(yīng)主要表現(xiàn)為累加作用。本研究為新型復(fù)方抗菌制劑的開發(fā)提供了初步的理論基礎(chǔ)。