朱亞召，王明麗，俞海洋，高耀輝，趙俊,3*

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，合肥 230032； 2.安徽九川生物科技有限公司，安徽蕪湖 241000；3. 蕪湖留學(xué)人員創(chuàng)業(yè)園，安徽蕪湖 241000)

干擾素是人和動物細(xì)胞在受到一定刺激時產(chǎn)生的一種微量、具有高度生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)，除了自身具有抗病毒作用，還有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等生物學(xué)功能[1]。重組豬α干擾素是將長白豬α干擾素型基因重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸埃希菌構(gòu)建表達(dá)的原核系統(tǒng)。豬α干擾素(PoIFN-α)對豬的流行性腹瀉、輪狀病毒腹瀉、傳染性胃腸炎等多種病毒性病有較好的療效，因此，其作為廣譜抗病毒藥可用于豬病毒性疾病的防治。但傳統(tǒng)的干擾素提取方法產(chǎn)量較低，難得到推廣應(yīng)用[2-3]。基因工程表達(dá)重組豬α干擾素蛋白的方法是通過基因工程技術(shù)合成和高密度發(fā)酵技術(shù)擴(kuò)大生產(chǎn)，可以有力地提高重組豬α干擾素蛋白的產(chǎn)量，同時縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資，并降低生產(chǎn)成本[4]。但目前國內(nèi)外少有關(guān)于重組豬ɑ干擾素發(fā)酵動力學(xué)的報道，同時實(shí)驗(yàn)室高密度發(fā)酵技術(shù)還不夠成熟，常受到微生物發(fā)酵過程中的變性和不確定性等因素影響，因此有必要深入地探索大腸埃希工程菌發(fā)酵生產(chǎn)重組豬α干擾素的發(fā)酵條件和動力學(xué)特征，這對提高重組豬α干擾素的產(chǎn)量具有重要意義。為建立大腸埃希工程菌分批發(fā)酵動力學(xué)模型，在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了重組豬α干擾素的分批發(fā)酵研究，以期實(shí)現(xiàn)對重組豬α干擾素生成過程的優(yōu)化和控制，降低成本，為后續(xù)放大實(shí)驗(yàn)和連續(xù)發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器 重組大腸埃希工程菌(BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNα)由安徽醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室提供。培養(yǎng)基種類及組成見表1。蛋白胨(OXOID，英國，批號：1765365，500 g)；酵母粉(OXOID，英國，批號：1378102，500 g)；氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20160310，500 g)。30 L發(fā)酵罐(比歐，瑞士)；紫外分光光度計(Varian公司，美國)；高壓蒸汽滅菌鍋(HIRAYAMA公司，日本)；重懸儀(IKA公司，德國)；恒溫?fù)u床(上海智誠分析儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)。

表1 培養(yǎng)基組成Tab 1 Medium components

培養(yǎng)基pH 7.0～7.2，補(bǔ)料培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基121 ℃ 20 min高壓滅菌

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 一級菌種：固體LB氨芐平板上挑取飽滿的單菌落接種到終濃度為100 mg/mL氨芐青霉素LB培養(yǎng)液中，37 ℃ 220 r/min培養(yǎng)12～16 h。二級菌液：將一級菌液以0.1%量接種于終濃度為100 mg/mL氨芐青霉素200 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min擴(kuò)大培養(yǎng)12 h。

1.2.2 分批發(fā)酵過程 在30 L發(fā)酵罐中加入發(fā)酵培養(yǎng)基12 L，同時添加0.05%的消泡劑，121 ℃ 20 min原位滅菌。冷卻后火圈接種200 mL種子培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基至發(fā)酵罐中，pH控制范圍：7.0 ± 0.1，溶氧控制20%以上，前期發(fā)酵溫度37±0.5 ℃，菌體生長階段每1 h取樣檢測相關(guān)參數(shù)，3 h后準(zhǔn)備誘導(dǎo)；誘導(dǎo)階段，加入終濃度0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，溫度為32±0.5 ℃，每1 h取樣1次檢測相關(guān)參數(shù)，直至發(fā)酵結(jié)束。共重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)條件相同，檢測手段相同。

1.3 發(fā)酵中參數(shù)測定

1.3.1 生物量(wet weight，g/L)測定 取發(fā)酵液30 mL于已知質(zhì)量的離心管中，12000 r/min離心20 min棄去上清，菌體沉淀經(jīng)蒸餾水洗滌離心兩次，收集沉淀。稱重，計算所得菌體濕重。

1.3.2 葡萄糖殘余含量(Amount of residual sugar，g/L)測定 取發(fā)酵液1 mL，12000 r/min離心5 min，收集上清后使用DNS法測得[5]。

1.3.3 全菌目的蛋白檢測 分別在誘導(dǎo)前1 h、誘導(dǎo)后1 h、2 h、3 h和4 h取樣1 mL進(jìn)行SDS-PAGE鑒定發(fā)酵液中全菌蛋白的表達(dá)[6]。

1.3.4 目的蛋白生物學(xué)活性(Protein titer, IU/mL)測定 采用細(xì)胞病變抑制法，使用成熟的ST細(xì)胞/VSV系統(tǒng)[7]對獲得重組豬α干擾素蛋白效價檢測。

1.4 數(shù)據(jù)分析和建模 每間隔1h取樣，對相關(guān)參數(shù)進(jìn)行檢測，為建立較為準(zhǔn)確的動力學(xué)模型，相同條件下，重復(fù)6次實(shí)驗(yàn)，取實(shí)驗(yàn)平均值作為結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，同時通過SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并使用Origin 8.0繪圖軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，繪制動力方程曲線，同時獲得最佳動力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 重組大腸埃希菌分批發(fā)酵過程的代謝特征 重組大腸埃希菌產(chǎn)重組豬α干擾素分批發(fā)酵過程見圖1，顯示了菌體濕重、殘?zhí)菨舛燃爸亟M豬ɑ干擾素效價隨時間(t)的變化趨勢。

圖1 重組大腸埃希菌分批發(fā)酵進(jìn)程曲線Fig 1 Recombinant E.coli batch fermentation process curve

圖1中菌體濕重呈典型的S型曲線變化。重組大腸埃希菌種子液接入發(fā)酵罐后生長分為4個階段：第一階段為延滯期，即重組大腸埃希菌接種到發(fā)酵罐的適應(yīng)期，圖1顯示重組大腸埃希菌適應(yīng)期很短，很快進(jìn)入繁殖期。第二階段為對數(shù)生長期，最大比生長速率出現(xiàn)在此階段。同時，該階段菌體相關(guān)酶活性達(dá)到最佳。為了達(dá)到較高的細(xì)胞密度和提高重組豬ɑ干擾素蛋白產(chǎn)量，選擇在對數(shù)生長中期，即在接種后第4 h加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)同時降溫至32 ℃，此時發(fā)酵進(jìn)入到第三階段為產(chǎn)物生成期。此時菌體比生長速率降低，產(chǎn)物開始積累，但培養(yǎng)基中葡萄糖濃度已經(jīng)較低，菌體比生長速率在下降，重組豬α干擾素生成，說明菌體生長和產(chǎn)物生成不存在偶聯(lián)關(guān)系。重組豬α干擾素是隨著添加誘導(dǎo)劑才生成的，故為非自發(fā)性誘導(dǎo)。隨著誘導(dǎo)進(jìn)行，重組豬α干擾素蛋白生物學(xué)升高，說明重組豬α干擾素表達(dá)量在增加，但在誘導(dǎo)后第5 h出現(xiàn)生物學(xué)活性降低，說明此時菌體開始進(jìn)入穩(wěn)定期。由于葡萄糖早已消耗殆盡，不能提供足夠的碳源。此時重組大腸埃希工程菌已到達(dá)平臺期，代謝廢物不斷積累，無法維持菌體正常的生長環(huán)境，大部分菌體不再繼續(xù)分裂生長，此時結(jié)束發(fā)酵。

2.2 分批發(fā)酵誘導(dǎo)后產(chǎn)重組豬α干擾素的SDS-PAGE鑒定分析 重組大腸埃希菌分批酵誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后取樣進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。未使用IPTG誘導(dǎo)，重組豬α干擾素未表達(dá)，使用IPTG誘導(dǎo)后在35.0 kD附近泳道3、4、5和6有相對應(yīng)條帶,對應(yīng)蛋白表達(dá)量上升，最終蛋白表達(dá)在25.4%左右(圖2)。

M：蛋白Marker；1：pET-32a(+)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌；2：重組豬ɑ干擾素誘導(dǎo)前1 h取樣全菌；3-6：重組豬ɑ干擾素誘導(dǎo)后1 h、2 h、3 h和4 h取樣全菌圖2 重組豬α干擾素誘導(dǎo)后發(fā)酵取樣蛋白鑒定結(jié)果Fig 2 Results of the identification of the fermentative sample protein after induction of the recombinant pig α interferon

2.3 發(fā)酵動力學(xué)模型的建立 使用基于菌體生長動力學(xué)的Logistic[8-9]、Luedeking-Piret[10]和類似 Luedeking-Piret等方程研究分批發(fā)酵中菌體生長、基質(zhì)消耗及產(chǎn)物生成間的動力學(xué)關(guān)系，通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，做出以下假設(shè)：(1) 發(fā)酵過程中菌體生長受自身濃度增加的抑制作用；(2) 葡萄糖的消耗僅用于菌體生長和維持菌體代謝。

2.3.1 菌體生長動力學(xué)模型 在微生物生長過程中，Monod動力學(xué)模型、邏輯方程和haldane模型[11]等非結(jié)構(gòu)化模型廣泛用于描述細(xì)胞生長，而Logistic方程的應(yīng)用卻最為廣泛，它能較好地描述分批發(fā)酵過程中因菌體濃度增加對菌體自身產(chǎn)生的抑制效應(yīng)[12]，能夠清楚地描繪菌體生長與營養(yǎng)間的關(guān)系曲線。有學(xué)者利用Logistic方程研究大腸埃希菌產(chǎn)青霉素?；竅13]、桑葚果酒發(fā)酵[14]、1，3-丙二醇分批發(fā)酵動力學(xué)[15]和仙人掌果酒發(fā)酵動力學(xué)及其氧化性[16]，結(jié)合測得并計算過后整理的相關(guān)數(shù)據(jù)，大腸埃希菌的菌體生長曲線為較標(biāo)準(zhǔn)的S型曲線，能夠表示出菌體生長和營養(yǎng)物間的關(guān)系。因此，采用 Logistic 方程研究重組大腸埃希菌的菌體生長動力學(xué)模型，得式(1)：

X為發(fā)酵過程中菌體生物量，g/L；μm為微生物的最大比生長速率，h；Xm為發(fā)酵過程中最大菌體質(zhì)量濃度，g/L；t為發(fā)酵過程需要的時間，h。

對式(1)進(jìn)行積分，化為代數(shù)式如下：

X0表示菌體初始濃度，g/L。

圖1中菌體濕重數(shù)據(jù)代入式(2)得生長動力學(xué)參數(shù)X0、Xm和μm值分別為0.35259、27.46236和1.01385，獲得菌體生長動力學(xué)方程，見式(3)，同時擬合得曲線方程R2=0.99030，擬合效果很好，故可選用Logistic方程作為菌體生長階段的動力學(xué)方程，見圖3。

X表示菌體濃度，g/L；t表示時間，h；R2=0.9903。

圖3中菌體生長擬合曲線符合“S”型曲線，菌體在進(jìn)入對數(shù)生長期4h時到達(dá)最大比生長速率，此時菌體酶活力達(dá)到最佳。故此時進(jìn)行誘導(dǎo)更有利于提高重組豬α干擾素的產(chǎn)量。

2.3.2 產(chǎn)物生成動力學(xué)模型 產(chǎn)物生成與菌體生長關(guān)系可分為產(chǎn)物生成與細(xì)胞生長偶聯(lián)、部分偶聯(lián)或者不相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，通過Luedeking等構(gòu)建的動力學(xué)方程中產(chǎn)物生成與細(xì)胞生長關(guān)系通過Luedeking-Piret方程進(jìn)行描述如下：

P表示蛋白產(chǎn)量，X為菌體對應(yīng)的生物量(g/L),α為生長偶聯(lián)系數(shù)，β則是非生長偶聯(lián)系數(shù)。方程中與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物生成用α表示，而與菌體量相關(guān)的產(chǎn)物生成用β表示，α，β均為常數(shù)。當(dāng)α=0，β≠0，表示產(chǎn)物生成與細(xì)胞無關(guān)；當(dāng)α≠0，對應(yīng)β=0或者≠0，表示部分偶聯(lián)和偶聯(lián)關(guān)系。

對圖1中重組豬α干擾素生物學(xué)活性擬合，得β值為0.01276，見式(6)。擬合得曲線見圖4，此時R2=0.91095，證明產(chǎn)物的生成可用該模型表示。

圖4中第5 h，取樣檢測到重組豬α干擾素，且隨著誘導(dǎo)發(fā)生，蛋白生物學(xué)活性提高，但在誘導(dǎo)后第9 h，效價有所下降，說明此時可以結(jié)束發(fā)酵過程。

S為葡萄糖質(zhì)量濃度，g/L；X為菌體生物量；YX/S為碳源用于生長的得率常數(shù)，g/g；YP/S為碳源用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)，g/g；γ為菌體維持系數(shù)，g/g。

圖3 重組大腸埃希菌菌體生長的模型方程Fig 3 Model equation of recombinant Escherichia coli growth

圖4 重組豬ɑ干擾素生成的模型方程Fig 4 Recombinant pig interferon α titer model equation

由于在誘導(dǎo)后的產(chǎn)物生成階段葡萄糖量很低，可以忽略不計，故化簡式(7)并結(jié)合式(2)，積分后得：

(8)

S0為初始葡萄糖濃度，g/L；λ=1/YX/S

菌體生長的X0、Xm和μm值分別代入式(8)，并利用圖1中殘?zhí)橇繑?shù)據(jù)非線性擬合，得到S0、λ和γ的值分別為11.89313、-0.44698和-0.6492，代入式(8)得基質(zhì)消耗與時間的關(guān)系見式(10)。

葡萄糖隨著重組大腸埃希菌的生長而消耗，尤其在進(jìn)入對數(shù)生長期后，葡萄糖的消耗主要用于維持細(xì)菌的生長。在誘導(dǎo)后第4 h，葡萄糖的急劇消耗不僅用于細(xì)菌的生長，還用于產(chǎn)物的生成。依圖1得出在第5 h時，葡萄糖含量已接近于穩(wěn)定，此時菌體比生長速率開始下降，即將進(jìn)入平臺期，進(jìn)行非線性擬合見圖5，R2=0.96683 ，證明該模型可以很好的反應(yīng)出基質(zhì)消耗情況。

圖5 葡萄糖消耗的動力學(xué)模型Fig 5 Dynamic model of glucose consumption

2.4 模型驗(yàn)證 為了驗(yàn)證模型的誤差，在相同實(shí)驗(yàn)條件下又進(jìn)行了重組大腸埃希菌分批發(fā)酵3次，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值，并把實(shí)驗(yàn)值和模型預(yù)測值相比較。經(jīng)驗(yàn)證，模型的最大相對誤差為8.9%，平均相對誤差為7.5%，故上述模型能較好地描述重組大腸埃希菌分批發(fā)酵動力學(xué)，模型的相對誤差較小，能夠很好的反映重組大腸埃希菌分批發(fā)酵過程，可為下一步發(fā)酵過程優(yōu)化提供指導(dǎo)。

3 結(jié) 論

研究利用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程建立了大腸埃希菌BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ分批發(fā)酵重組豬ɑ干擾素的過程，形成了菌體生長、產(chǎn)物生成和基質(zhì)消耗動力學(xué)模型，分別為：

4 討 論

國內(nèi)外關(guān)于干擾素抗病毒的研究開始于20世紀(jì)50年代，集中在干擾素抗病毒作用。隨著近現(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，大批量生產(chǎn)干擾素已變得有可能。研究中針對重組大腸埃希菌BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ在30L發(fā)酵罐中摸索出產(chǎn)重組豬ɑ干擾素的相關(guān)規(guī)律，對影響反應(yīng)的因素進(jìn)行了整理，采用Logistic方程、Luedeking-Piret方程和類Luedeking-Piret方程模型描述了菌體發(fā)酵過程的特性，并經(jīng)過非線性擬合優(yōu)化得到相關(guān)模型參數(shù)，擬合效果較好。這為后續(xù)的發(fā)酵工藝改進(jìn)、蛋白活性提高、發(fā)酵過程的方法控制以及后續(xù)的補(bǔ)料分批模型積累了經(jīng)驗(yàn)，并提供了指導(dǎo)。

在建立重組豬干擾素α的菌體生長動力學(xué)方程中，是基于菌體的濕重測量法建立的菌體生長隨時間變化的關(guān)系，擬合得到的菌體生長曲線是符合經(jīng)典的“S”型曲線，擬合效果較好。丁雪利用固態(tài)發(fā)酵料干物質(zhì)損失量表示菌體生物量，成功建立了熱帶假絲酵母固態(tài)發(fā)酵菌體生長動力學(xué)模型[17]，田雪、謝鑫和周曉航等關(guān)于地衣芽孢桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶分批發(fā)酵動力學(xué)模型的建立[18]使用菌體干重表示菌體生長，不足之處在于干重法的誤差較小，在這方面還需改進(jìn)。另一方面重組豬干擾素α目的蛋白是分泌型表達(dá)，故通過細(xì)胞病變抑制法可以準(zhǔn)確且穩(wěn)定地獲得其目的蛋白的效價，且蛋白表達(dá)量和生物學(xué)活性較高，這和菌體自身為pET-32a載體有關(guān)構(gòu)建的可溶性表達(dá)有關(guān)，可以為后續(xù)相關(guān)重組蛋白的構(gòu)建提供可行的指導(dǎo)。

目前初步完成了重組工菌的分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?，下一步將從工藝?yōu)化著手，尤其是從補(bǔ)料發(fā)酵開始做進(jìn)一步精細(xì)的研究，構(gòu)建其補(bǔ)料發(fā)酵動力學(xué)模型，獲得優(yōu)化后的補(bǔ)料策略，為BL21(DE3)/pET-32a-rPoIFNɑ在后續(xù)的高密度發(fā)酵甚至擴(kuò)大到工業(yè)化生產(chǎn)上奠定基礎(chǔ)。