喻琴，陳玲，尹伶靈，張世棟，董書偉，劉升，呂鳳霞，那立冬，閆寶琪，楊洪早，王東升*，嚴作廷*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所,農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅省中獸藥工程技術(shù)研究中心，蘭州 730050；2.山東省獸藥質(zhì)量檢驗所，濟南 250022；3.河南牧翔動物藥業(yè)有限公司，鄭州 451162)

外感風熱是雞的臨床常見病癥之一，主要是動物感受風熱邪氣而發(fā)病，多見于風熱感冒或溫熱病的初期，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、體溫升高、咳嗽、流涕[1-3]。臨床研究表明，魚腥草芩藍口服液對人患外感風熱有顯著療效[4]，魚腥草芩藍口服液用于治療雞外感發(fā)熱，主要由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹和金銀花等組成，具有清熱解毒作用。為了考察魚腥草芩藍口服液的毒性，進行毒理學研究，以期為臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥物 魚腥草芩藍口服液，河南牧翔動物藥業(yè)有限公司的中試產(chǎn)品，批號：20140905，規(guī)格：每100 ml相當于原生藥量為170 g。

1.2 試驗動物 昆明系小鼠50只，清潔級，體重18～22 g，雌雄各半。SD大鼠80只，普通級，體重90～110 g，雌雄各半。均購自蘭州大學醫(yī)學院試驗動物中心，合格證號：SCXK(甘)2009-0004。動物飼養(yǎng)在20～22℃，相對濕度為45～55%的實驗室內(nèi)，雌雄分開飼養(yǎng)，每次試驗前先適應性飼養(yǎng)5 d。

1.3 主要儀器與試劑 CP223C電子天平(奧豪斯儀器上海有限公司)、JM5102電子天平(余姚紀銘稱重校驗設備有限公司)、pocH-100i Veterinary血細胞分析儀(日本Sysmex希森美康公司)、BS-420全自動生化分析儀(深圳邁瑞)、KD-H生物組織切片烘片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、KD-P生物組織切片攤片機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)、RM2235石蠟切片機(徠卡儀器有限公司)、 DHG-9240B恒溫鼓風干燥箱(上海實驗設備有限公司)。

1.4 試驗方法

1.4.1 急性毒性試驗

1.4.1.1 半數(shù)致死量試驗 測定半數(shù)致死量(LD50)[5-7]。選用健康昆明小鼠30只，體重18～22 g，隨機分為3組，每組10只，雌雄各半。即第1組(17 g/kg)、第2組(34 g/kg)、第3組(51 g/kg)，初次給藥前禁食不禁水12 h，24 h內(nèi)灌胃給藥3次，給藥后連續(xù)觀察7 d，觀察小鼠的精神狀態(tài)，飲食，被毛，二便等有無異常。試驗結(jié)束后，將所有存活的小鼠頸椎脫臼處死、剖檢，觀察小鼠的主要臟器(心、肝、腎、脾、肺及胃腸)等臟器有無異常。若無異常，進行急性毒性最大耐受量試驗。

1.4.1.2 最大給藥量試驗 參照文獻方法[8-10]，選用健康小鼠20只，體重18～22 g，雌雄各半。初次給藥前禁食不禁水12 h，24 h內(nèi)按68 g/kg灌胃給藥3次，給藥后連續(xù)觀察10 d，主要觀察指標同1.4.1.1。

1.4.2 長期毒性試驗 參照文獻[11-13]，選取健康SD大鼠80只，雌雄各半，隨機分為對照組和高、中、低劑量組，每組20只，每籠5只。對照組按20 ml/kg灌服生理鹽水，高、中、低劑量組分別按34、17、8.5 g/kg灌服魚腥草芩藍口服液，每天一次，連續(xù)給藥35 d。試驗期間，觀察大鼠的精神狀態(tài)、外觀體征、糞便等情況等，記錄動物的異常表現(xiàn)及死亡情況。給藥期間每周測定體重一次，其中給藥期在給藥前稱重，解剖動物剖檢前先測定體重。末次給藥24 h后，用1%戊巴比妥麻醉大鼠，用EDTA-Na抗凝和普通真空管采集血液，分別用于檢測血液學和血液生化指標。采血后頸椎脫臼處死，對主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)進行稱重，并計算其臟器指數(shù)，用光學顯微鏡觀察臟器的組織病理學變化。

臟器指數(shù)=臟器濕重/動物體重*100%

1.4.2.1 血常規(guī)和血生化指標 用血細胞分析儀檢測血常規(guī)指標，檢測指標有：白細胞數(shù)目(WBC)、紅細胞數(shù)目(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞體積(MCV)、平均紅細胞血紅蛋白含量(MCH)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板數(shù)目(PLT)。用血生化分析儀檢測血生化指標，檢測指標有：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酐(CR)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、總膽紅素(T-BiL)、直接膽紅素(D-Bil)、總膽固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性毒性試驗

2.1.1 半數(shù)致死量試驗 試驗期間，小鼠精神狀態(tài)良好，飲食、被毛、二便等正常。小鼠解剖檢查后，臟器無肉眼可見病理變化。小鼠高劑量灌胃給藥3次后，沒有出現(xiàn)死亡和毒性反應。毒理學評價標準，當LD50>5000 mg/kg為實際無毒，魚腥草芩藍口服液LD50大于204 g/kg，無法測出該藥的LD50，所以進行最大給藥量試驗。

2.1.2 最大給藥量試驗 除在每次給藥后1 h內(nèi)，小鼠表現(xiàn)稍有不適，活動減少，其他時間小鼠精神狀況良好，沒有出現(xiàn)死亡和毒性反應。處死小鼠后，主要臟器無眼觀可見病理變化。小鼠的最大耐受量大于204 g/kg。觀察的10 d時間內(nèi)，無中毒癥狀出現(xiàn)，所有小鼠食欲、精神狀態(tài)均正常，采食、飲水、排便等活動正常，無小鼠死亡。

2.3 長期毒性試驗

2.3.1 一般狀況觀察 試驗期間，大鼠精神狀態(tài)良好，皮膚和被毛整潔，采食、運動、二便正常，沒有出現(xiàn)毒性反應和死亡情況。

2.3.2 生長狀況觀察 試驗期間，動物未出現(xiàn)食欲廢絕，大鼠體重見表1，可以看出動物體重隨周齡增長而增長，魚腥草芩藍口服液對其體重沒有顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，魚腥草芩藍口服液對大鼠生長無明顯影響。

表1 對大鼠體重的影響單位：gTab 1 Effects on body weight of unit：g

與對照組相比， *P<0.05， **P<0.01。下同

Compared to control group，*P<0.05，**P<0.01. The same below.

2.3.3 大鼠臟器指數(shù)變化 試驗結(jié)束后，各組動物臟器：形態(tài)和位置正常，色澤良好，臟器表面和內(nèi)膜正常。魚腥草芩藍口服液各試驗組大鼠的肝、脾、腎、心、肺的臟器指數(shù)與對照組相比，沒有顯著性差異(P>0.05)，表明魚腥草芩藍口服液給藥前后對動物的臟器指數(shù)沒有明顯影響，見表2。

表2 對大鼠臟器指數(shù)的影響單位：% Tab 2 Effects of on organ index of unit: %

2.3.4 魚腥草芩藍口服液對大鼠血常規(guī)指標的影響

由表3可知，與對照組相比，魚腥草芩藍口服液各試驗組大鼠血常規(guī)無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)果表明，魚腥草芩藍口服液對大鼠的血常規(guī)指標沒有影響。

2.3.5 魚腥草芩藍口服液對大鼠血液生化指標的影響 由表4可知，與對照組相比，魚腥草芩藍口服液對大鼠的血生化無顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明，魚腥草芩藍口服液對大鼠的血液生化指標沒有影響。

表3 對大鼠血常規(guī)指標的影響Tab 3 Effects on hematology indexes of

表4 對大鼠血液生化指標的影響Tab 4 Effects on serum biochemical indexes of

續(xù)表

2.3.6 病理組織學檢查 試驗結(jié)束后，取大鼠的肺、心、肝、脾、腎組織，于10%中性福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋、切片，HE染色后于普通顯微鏡下觀察，病理圖片如下，可以看出各給藥組與對照組相比均未見任何病理變化。

對照組肺臟(10×40) 試驗組肺臟(10×40)

對照組心臟(10×40) 試驗組心臟(10×40)

對照組肝臟(10×40) 試驗組肝臟(10×40)

對照組脾臟(10×40) 試驗組脾臟(10×40)

對照組腎臟(10×40) 試驗組腎臟(10×40)

3 討論與結(jié)論

急性毒性試驗是通過1次大劑量給藥或24 h內(nèi)多次給藥后，在一定時間內(nèi)觀察動物所產(chǎn)生的毒性反應和死亡過程，進而測定引起動物急性中毒的劑量，揭示動物在中毒過程中出現(xiàn)的毒性反應和靶器官。藥物的毒性劑量常采用測定動物的半數(shù)致死量(LD50)、最小致死量(LD5)和最大給藥量(MTD)等方法。許多中藥的毒副作用很小，常常無法測出LD50。因此中藥尤其是中藥復方制劑的急性毒性試驗常采用最大給藥量試驗[5,14-15]。結(jié)果顯示，在用藥期間各劑量組的昆明系小鼠均未出現(xiàn)因藥物原因而死亡的情況，測得魚腥草芩藍口服液的最大耐受量為204 g/kg，且對小鼠的內(nèi)臟器官的形態(tài)及質(zhì)地無明顯的影響。

長期毒性試驗也稱反復給藥的毒性試驗，在實驗過程中需要觀察動物在反復給藥過程中的毒性反應[16]，了解藥物劑量與中毒程度的關(guān)系及毒性反應的靶器官，確定動物的最大耐受量和無毒性反應的安全劑量。在藥物安全評價中，由于藥物作用的影響，常會引起動物一些器官質(zhì)量的減低，根據(jù)臟器系數(shù)來檢驗動物的臟器是否受到藥物的不良影響[17]。試驗結(jié)果表明，魚腥草芩藍口服液以34、17、8.5 g/kg劑量，連續(xù)用藥35 d，在觀察期內(nèi)未見大鼠有不良反應，精神狀態(tài)良好、飲食正常，魚腥草芩藍口服液各劑量組對主要臟器的臟器系數(shù)未見明顯的影響，對試驗大鼠心、肝、肺、脾、腎等主要臟器未見肉眼及組織學病理變化。

血液生理指標是判定藥物毒性的重要指標，試驗結(jié)果顯示，紅細胞數(shù)、白細胞數(shù)、血紅蛋白的含量等血液常規(guī)指標與對照組比較差異均不顯著，提示在試驗劑量下，大鼠血細胞功能不會受到受試藥物影響，均能正常發(fā)揮作用。血液生化指標是測定藥物對主要臟器的毒性作用，在血液生化指標中 ALT、AST、ALB 等與肝功能有密切關(guān)系[18-19]，ALB、BUN 等則與腎功能有關(guān)[20]。血液生化指標顯示，低、中、高劑量組與對照組比較，各試驗組大鼠血液生化指標均在正常范圍內(nèi)變動，表明魚腥草芩藍口服液對小鼠生理生化功能沒有影響。

魚腥草芩藍口服液在最大濃度且小鼠最大灌藥量204 g/kg的情況下，沒有找出魚腥草芩藍口服液引起小鼠死亡的劑量。魚腥草芩藍口服液以34、17、8.5 g/kg體重對大鼠連續(xù)35 d 灌胃給藥，在用藥期間各劑量組的大鼠均未出現(xiàn)因藥物原因而死亡的情況，對大鼠的體重、生長發(fā)育、血常規(guī)、血液生化學指標和臟器系數(shù)均未見影響，對主要臟器未見明顯病理變化。根據(jù)新獸藥一般毒性試驗技術(shù)要求，短期給予藥物毒性較低，屬于實際無毒，在臨床上應用是安全的。