吳玉丹，戴發(fā)亮，董仕楨，郭騰飛，高 磊，常永超，高 強(qiáng)

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河南洛陽 471023 2)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；河南科技大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 河南洛陽 471023 3)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京康復(fù)醫(yī)院消化內(nèi)科 北京 100144

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn′s Disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一種腸道慢性非特異性炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，目前認(rèn)為與遺傳易感性、環(huán)境、感染、菌群失調(diào)、腸黏膜免疫應(yīng)答失衡及腸上皮功能障礙等因素有關(guān)[1]。近年來我國IBD臨床診治數(shù)量明顯增多[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是與蛋白質(zhì)折疊修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌功能有關(guān)的一種重要細(xì)胞器；未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量蓄積可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。腸上皮細(xì)胞ERS導(dǎo)致的腸黏膜屏障損傷是IBD的重要原因[3]。機(jī)體可通過啟動(dòng)一系列適應(yīng)性反應(yīng)即“未折疊蛋白反應(yīng)”(unfolded protein response，UPR)[4]來減輕ERS對細(xì)胞的損害，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。ERS主要通過3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜感受器觸發(fā)UPR，肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1，IRE1) 是UPR的一個(gè)重要傳感器，消化道表面表達(dá)有IRE1亞型(IRE1α和IRE1β)，磷酸化IRE1α(p-IRE1α)是其活化形式。在長期ERS狀態(tài)下，IRE1α可以促進(jìn)基因編碼的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向蛋白質(zhì)的降解，降低ERS的蛋白負(fù)荷，這個(gè)過程被稱為依賴IRE1調(diào)節(jié)的衰減作用(regulated IRE1-dependent decay，RIDD)[5-6]。維甲酸誘導(dǎo)基因I (retinoic acid induced gene-I，RIG-I)參與IRE1-RIDD-RIG-I通路，這個(gè)通路與黏膜固有免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)[7-9]。RIG-I是DexD/H盒的RNA解旋酶家族的成員，在細(xì)胞內(nèi)作為受體識(shí)別病毒雙鏈RNA。最近研究[10]表明，RIG-I不僅具有抗病毒功能，還參與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖或凋亡、吞噬、免疫調(diào)節(jié)等諸多生物學(xué)事件。有關(guān)IRE1-RIDD-RIG-I通路在IBD的發(fā)病機(jī)制尚不明確。該研究通過分析IRE1和RIG-I在葡聚糖硫酸鈉(dextran sulphate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠慢性結(jié)腸炎模型的表達(dá)情況來探討IRE1-RIDD-RIG-I通路在IBD發(fā)病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～10周齡健康清潔級(jí)C57BL/6(B6)雌性小鼠購自北京維通利華公司，體重為20～23 g，用混合配方顆粒飼料(北京華阜康生物科技股份有限公司)飼養(yǎng)于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院新區(qū)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，正常飲用無菌蒸餾水。

1.2主要試劑與儀器DSS(美國MP Biomedicals公司)；戊巴比妥鈉(德國Merck公司)；Trizol法總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)；RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；免疫組化檢測和蛋白印跡Western blot檢測用RIG-I一抗(英國Abcam公司)，p-IRE1一抗(美國Thermo公司)；免疫組化檢測SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；RIPA裂解液試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA試劑盒(美國Pierce公司)；ECL試劑盒(美國Santa Cruz公司)；RT-PCR儀(美國Bio-Rad公司)；光學(xué)拍照顯微鏡系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、造模及取材處理造模前，小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為2組，每組8只。對照組：飲用無菌蒸餾水；慢性炎癥組：先自由飲用10 g/L DSS溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)7 d，然后飲用無菌蒸餾水14 d，3周為一個(gè)周期(共3個(gè)周期)建立小鼠慢性結(jié)腸炎模型。于造模第10周末腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后頸椎脫臼法處死小鼠，剖腹取全結(jié)腸，測量長度。記錄結(jié)腸內(nèi)是否有血性內(nèi)容物，PBS漂洗并翻轉(zhuǎn)結(jié)腸，從遠(yuǎn)端起取第一段約0.5 cm放于包埋框，浸泡于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛中固定，石蠟包埋， 4 μm厚切片以備HE和免疫組化染色用；取第二段約1.0 cm結(jié)腸置于含RNA later液的離心管，先在4 ℃冰箱放置24 h后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，用于相關(guān)mRNA的檢測；再取第三段約1.0 cm放入1.5 mL離心管，液氮凍存后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱，用于Western blot。

1.4兩組小鼠結(jié)腸組織學(xué)表現(xiàn)、疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分、結(jié)腸長度變化及腸道炎癥程度評(píng)分實(shí)驗(yàn)期間每3 d于早晨9:00測量各組小鼠體重1次，觀察小鼠活動(dòng)、攝食和飲水情況，記錄大便性狀、是否便血及便血程度。HE染色觀察結(jié)腸組織學(xué)變化：在高倍鏡(×400)下，每張切片選擇10個(gè)視野共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞。參照J(rèn)ackson等[11]的方法進(jìn)行DAI評(píng)分，DAI取體重下降百分比、大便性狀、便血評(píng)分三者均值(取材時(shí)測量結(jié)腸長度，依據(jù)張靜等[12]的方法進(jìn)行便血評(píng)分)。腸道炎癥程度評(píng)分參照Esworthy等[13]的方法。

1.5兩組小鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-8、TNF-α、IRE1α及RIG-ImRNA表達(dá)水平的檢測采用Trizol法提取小鼠結(jié)腸組織總RNA，測定RNA純度和濃度后取RNA 2 μg，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存。冰上配制PCR反應(yīng)體系(共25 μL)：SYBR Premix EX TaqⅡ(×2)12.5 μL，上下游引物各1 μL(濃度10 μmol/L)，RNase-Free水8.5 μL，cDNA 2 μL。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性 5 s；根據(jù)引物Tm值設(shè)置退火溫度，退火時(shí)長30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各指標(biāo)mRNA相對表達(dá)量。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成(表1)。

表1 引物名稱及序列

1.6兩組小鼠結(jié)腸組織中p-IRE1α、RIG-I蛋白表達(dá)的免疫組化檢測按照免疫組化檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。p-IRE1α一抗按1∶500稀釋，RIG-I一抗按1∶600稀釋，生物素化山羊抗兔IgG作為二抗。用PBS緩沖液代替一抗和二抗作陰性對照。DAB顯色，蘇木精復(fù)染；干燥封片后在高倍鏡(×400)下，參考文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的方法觀察p-IRE1α、RIG-I蛋白的表達(dá)情況。

1.7兩組小鼠結(jié)腸組織中p-IRE1α、RIG-I蛋白表達(dá)的定量分析取40～60 mg小鼠結(jié)腸組織置于勻漿器中，加入1 mL RIPA裂解液，充分勻漿后離心取

上清。BCA法測定蛋白濃度。將蛋白稀釋成適當(dāng)濃度，100 ℃變性5 min，加20 μg樣品進(jìn)行SDS-PAGE，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉溶液封閉，分別滴加p-IRE1α和RIG-I抗體一抗(按1∶500稀釋)、二抗(按1∶2 000稀釋)，ECL顯色1或3 min，成像系統(tǒng)成像后用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0進(jìn)行分析，應(yīng)用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較兩組小鼠DAI、結(jié)腸長度、腸道炎癥程度評(píng)分以及結(jié)腸組織中炎性因子、IRE1α、RIG-I mRNA及蛋白表達(dá)的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1兩組小鼠一般活動(dòng)情況觀察對照組小鼠每天飲水?dāng)z食正常，反應(yīng)機(jī)警，大小便正常，體重增加。慢性炎癥組造模開始后小鼠即出現(xiàn)精神萎靡，體重減輕；第7天小鼠均出現(xiàn)稀血便。在第一個(gè)周期結(jié)束時(shí)，慢性炎性組平均體重下降最多；造模結(jié)束時(shí)，兩組小鼠均無死亡；部分小鼠大便潛血實(shí)驗(yàn)陽性，無明顯肉眼血便。

2.2兩組小鼠結(jié)腸組織學(xué)表現(xiàn)情況、DAI評(píng)分、結(jié)腸長度變化及腸道炎癥程度評(píng)分比較見圖1、表2。對照組小鼠組織病理學(xué)顯示結(jié)腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)完整，未見炎癥細(xì)胞浸潤；慢性炎癥組結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則，腺體萎縮，細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，隱窩異常，杯狀細(xì)胞消失，局部炎癥細(xì)胞浸潤，并可見隱窩呈慢性炎癥改變伴不規(guī)則增生。造模結(jié)束后，慢性炎癥組DAI評(píng)分、腸道炎癥程度評(píng)分均高于對照組，結(jié)腸長度短于對照組。

A：對照組；B：慢性炎癥組圖1 兩組小鼠結(jié)腸組織學(xué)表現(xiàn)(HE，×200)表2 兩組小鼠DAI評(píng)分、結(jié)腸長度及腸道炎癥程度評(píng)分比較(n=8)

組別造模結(jié)束時(shí)DAI評(píng)分/分結(jié)腸長度/cm腸道炎癥程度評(píng)分/分對照組0.03±0.016.8±0.30.02±0.01慢性炎癥組3.50±0.705.7±0.29.20±0.40t8.7038.0708.852P<0.001<0.001<0.001

2.3兩組小鼠結(jié)腸組織中炎性因子、IRE1α、RIG-ImRNA及蛋白的表達(dá)比較見表3、圖2和3。由圖3可知，p-IRE1α主要在結(jié)腸上皮細(xì)胞刷狀緣、漿細(xì)胞等細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)；RIG-I蛋白主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的胞質(zhì)、間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)中。

表3 兩組小鼠結(jié)腸組織中炎性因子、IRE1α、RIG-I mRNA及蛋白的表達(dá)比較(n=8)

A：RIG-I蛋白； B：IRE1α蛋白；1：對照組；2：慢性炎癥組圖2 兩組小鼠結(jié)腸上皮組織中RIG-I和IRE1α蛋白免疫組化結(jié)果(DAB，×400)

圖3 兩組小鼠結(jié)腸上皮組織中RIG-I和p-IRE1α蛋白的Western blot結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)用DSS誘導(dǎo)B6小鼠，經(jīng)過3個(gè)周期共10周的造模誘導(dǎo)小鼠慢性結(jié)腸炎來模擬人UC的發(fā)生發(fā)展過程。造模過程中，腸炎小鼠與人類UC有相似癥狀，如體重減輕、腹瀉、血便等；慢性炎癥組小鼠結(jié)腸縮短，且縮短程度與炎癥程度一致，病理表現(xiàn)為黏膜結(jié)構(gòu)不規(guī)則，隱窩結(jié)構(gòu)紊亂，腺體變形萎縮，黏膜及黏膜下層大量炎癥細(xì)胞浸潤等，同時(shí)伴有DAI增高；TNF-α、IL-8、IL-6 mRNA升高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示慢性炎癥組IRE1α mRNA、RIG-I mRNA、p-IRE1α和RIG-I蛋白的表達(dá)量低于對照組，表明IRE1-RIDD-RIG-I通路在炎癥時(shí)被抑制。IRE1-RIDD-RIG-I通路在黏膜表面的固有免疫應(yīng)答將針對某些微生物的先天性免疫應(yīng)答信號(hào)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)聯(lián)，影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能[9]。IRE1不僅可以作為防御受體也可作為模式識(shí)別受體，感知外源入侵的病原微生物和內(nèi)源性的未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，并根據(jù)不同的應(yīng)激狀態(tài)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能。在應(yīng)激狀態(tài)下，活化的p-IRE1 激活細(xì)胞內(nèi)激酶和核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域移碼剪切XBP1的mRNA(XBP1u)成為具有活性的XBP1s而進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，同時(shí)把其他mRNA剪切為未標(biāo)記的片段呈遞給配體感受器RIG-I，激活的RIG-I通過下游接頭蛋白MAVS(也稱IPS-1、CARDIF或VISA)誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素IFN的產(chǎn)生、NF-κB調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[8]。長期ERS狀態(tài)下，RIDD過程可以通過降解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)蛋白和下調(diào)Caspase 2觸發(fā)細(xì)胞凋亡?；罨亩嗑刍疘RE1還可以通過TRAF2激活A(yù)SK1-JNK/IKK通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。據(jù)Coelho等[5]報(bào)道，IRE1除了XBP1還有更廣泛的mRNA作用底物范圍，隨后這也在裂殖酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到證實(shí)。Maurel等[16]提出XBP1剪切與RIDD是 IRE1核糖核酸酶活化調(diào)控的兩種不同細(xì)胞反應(yīng)，兩者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不同的命運(yùn)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p-IRE1α、RIG-I的表達(dá)下降導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)能力減弱，可能參與了IBD的發(fā)生和發(fā)展。新近的研究[10]顯示RIG-I在人和小鼠結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌組織中表達(dá)也下調(diào)，且RIG-I缺乏的小鼠與野生型小鼠相比腸道菌群紊亂，IgA、 Reg3γ和 Pdcd1表達(dá)水平降低，因此，IRE1-RIDD-RIG-I通路的激活可能影響腸道菌群，并且導(dǎo)致潘氏(Paneth)細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分泌功能(如分泌抗菌肽和黏蛋白等)異常，使正常腸道抗菌作用和黏蛋白屏障受損進(jìn)而引起持續(xù)的炎癥刺激，影響IBD的發(fā)生和發(fā)展。此外，IRE1-RIDD-RIG-I通路的下調(diào)可能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的自噬功能減弱，從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解異常蛋白質(zhì)的能力，這也與以往報(bào)道[17-18]的未折疊蛋白反應(yīng)與自噬和固有免疫密切相關(guān)，自噬功能受損會(huì)促進(jìn)IBD的發(fā)生和發(fā)展一致。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在腸道慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中IRE1-RIDD-RIG-I通路被抑制，這種抑制可能促進(jìn)了炎癥的發(fā)生和發(fā)展，其具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，以期為IBD的治療提供新靶點(diǎn)。

致謝：感謝軒青霞、馮丹丹、陳攀、邢瑩瑩和張臘梅在實(shí)驗(yàn)中給予的大力幫助。