Alexander J. Schuyler, BS, BA; Jeffrey M. Wilson, MD, PhD; Anubha Tripathi, MD; Scott P. Commins, MD, PhD; Princess U. Ogbogu, MD; Patrice G. Kruzsewski, DO; Barrett H. Barnes, MD; Emily C. McGowan, MD, PhD; Lisa J. Workman, BA; Jonas Lidholm, PhD; Sheryl L. Rifas-Shiman, MPH; Emily Oken, MD, MPH; Diane R. Gold, MD, MPH; Thomas A. E. Platts-Mills, MD, PhD; Elizabeth A. Erwin, MD

翻譯：陳軒馥 審校：楊 紅 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科

嗜酸性粒細(xì)胞性食管炎(eosinophilic esophagitis，EoE)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的慢性食管炎癥[1]。據(jù)估計(jì)該病在美國(guó)的患病率為0.05%～0.10%，并呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中所有年齡段的男性均可能有受累[2]。EoE患者，特別是兒童，可出現(xiàn)一系列癥狀[3-6]。采取要素飲食后得到的組織學(xué)和臨床反應(yīng)證明食物變應(yīng)原對(duì)EoE有重要影響[7-9]。牛乳(Cow’s milk，CM)一直被認(rèn)為是EoE的一個(gè)主要變應(yīng)原，而小麥、雞蛋、大豆和花生也與之相關(guān)[10-11]。然而，我們對(duì)食物的免疫應(yīng)答機(jī)制以及這種免疫應(yīng)答的致病性尚未完全清楚。

目前有多種證據(jù)對(duì)抗食物特異性IgE(specific IgE，sIgE)抗體在EoE中產(chǎn)生致病作用有所爭(zhēng)議，包括(1)缺乏食物攝入時(shí)的即時(shí)癥狀；(2)臨床試驗(yàn)中抗IgE治療的效果差；(3)皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)或免疫固相變應(yīng)原芯片(immune solid phase transition response chip，ISAC)對(duì)致病性食品的預(yù)測(cè)價(jià)值低[3-6,11-15]。但是，我們不能完全否認(rèn)IgE的作用。我們研究小組的相關(guān)研究已經(jīng)證明，抗食物sIgE在EoE患者中非常常見(jiàn)[12]，并且使用大容量ImmunoCAP測(cè)定法測(cè)定sIgE抗體時(shí)，大多數(shù)EoE患者的抗牛乳蛋白(α乳清蛋白[Bos d 4]、β乳球蛋白[Bos d 5]和酪蛋白[Bos d 8])sIgE抗體為陽(yáng)性[16]。此外，我們已經(jīng)報(bào)道了低滴度抗牛乳IgE(0.10～1.00 U/ml)與EoE患兒在無(wú)牛乳飲食后的組織學(xué)緩解相關(guān)[15]。

在EoE患者中，另一種引起注意的同種型抗體是IgG4。IgG4具有抗炎活性，常被認(rèn)為介導(dǎo)變應(yīng)原耐受[17-18]。最近有2個(gè)研究報(bào)道了在成人EoE患者的血清和食管活檢組織標(biāo)本中存在抗食物提取物(包括牛乳和小麥)的特異性IgG4(sIgG4)抗體[13,19]，而這些結(jié)果的臨床意義尚不明確，一方面因?yàn)閷?duì)人群中血清抗食物蛋白sIgG4含量的研究仍不充分，另一方面是因?yàn)檫€沒(méi)有關(guān)于sIgE的平行分析。此外，目前并沒(méi)有EoE患兒對(duì)食物產(chǎn)生sIgG4應(yīng)答的報(bào)道，也沒(méi)有分層分析結(jié)果顯示不同性別之間是否存在差異。

為解決這些問(wèn)題，我們采用以分子變應(yīng)原為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，研究EOE患兒抗牛乳、小麥、雞蛋、大豆和花生的血清IgE和IgG4水平，并將結(jié)果與波士頓同年齡段出生隊(duì)列(項(xiàng)目Viva)的人群相比較，該隊(duì)列的樣本未曾選擇任何遺傳過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)或疾病，是一組包括變態(tài)反應(yīng)體質(zhì)和非變態(tài)反應(yīng)體質(zhì)兒童的自然人群[20]。我們還擴(kuò)展分析了性別、年齡和牛乳攝入量對(duì)sIgG4水平的影響。

1 方法

1.1 受試者

所有受試者獲得知情同意后，共收集俄亥俄州哥倫布市兒童醫(yī)院(Columbus, Ohio[n=35])及弗吉尼亞大學(xué)(Charlottesville, Va)([n=36])共71例初治或處于活動(dòng)期的EoE患兒的血清標(biāo)本，這些患兒已通過(guò)食管活組織檢查證實(shí)為EoE[每高倍鏡下(eos/HPF)≥15個(gè)嗜酸性粒細(xì)胞]。對(duì)照組是從波士頓州出生隊(duì)列(項(xiàng)目Viva)研究中隨機(jī)抽取的210例樣本，該隊(duì)列包括647名兒童幼兒期的血液標(biāo)本。對(duì)照樣本的納入標(biāo)準(zhǔn)和注冊(cè)細(xì)節(jié)以及研究二次分析的描述見(jiàn)在線(xiàn)內(nèi)容www.jacionline.org中的方法部分。

1.2 免疫測(cè)定法

使用ImmunoCAP 250儀器(Thermo Fisher Scientific, Uppsala, Sweden)檢測(cè)血清中抗牛乳、小麥、蛋清、大豆和花生提取物的IgE抗體滴度，總IgE滴度，抗麩質(zhì)、麥膠蛋白、nBos d 4、 nBos d 5、nBos d 6、nBos d 8、牛乳鐵蛋白(Bos d LF)、半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-gal)、rTri a 14、rTri a 19、nGal d 1、nGal d 2、nGal d 4、nGly m 4、nGly m 5、nGly m 6、rAra h 1、rAra h 2、rAra h 3、rAra h 8和 rAra h 9的sIgG4滴度，以及總IgG4滴度(本文在線(xiàn)內(nèi)容，表E1)。只有抗牛乳全提取物sIgE抗體陽(yáng)性的血清才進(jìn)一步檢測(cè)抗單一牛乳蛋白的sIgE。乳鐵蛋白和α-gal的測(cè)定是通過(guò)將從牛乳(Sigma-Aldrich, St Louis, Mo)中純化的生物素化乳鐵蛋白或連接于人血清白蛋白(V-Labs, Covington, La)的α-gal結(jié)合到鏈霉親和素ImmunoCAP上完成的[21]。

IgG4結(jié)果≥0.07 μg/ml為陽(yáng)性，IgE結(jié)果≥0.10 U/ml為陽(yáng)性。為了定量比較sIgE和sIgG4的結(jié)果，1 U/ml IgE = 2.42 ng/ml[22]?？侷gG4和其他特異性IgG抗體測(cè)量細(xì)節(jié)見(jiàn)本文在線(xiàn)內(nèi)容的方法部分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Mann-Whitney檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)(根據(jù)情況可選擇Fisher精確檢驗(yàn))分析EoE患者與對(duì)照組間人口基線(xiàn)特征信息、臨床資料和抗體滴度之間的差異；多組間的抗體滴度差異采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。飲食干預(yù)前后的抗體滴度變化采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估。采用Logistic回歸分析抗牛乳sIgE和sIgG4水平與EoE之間的相關(guān)性。根據(jù)年齡、性別和牛乳攝入情況進(jìn)行模型調(diào)整。牛乳攝入情況通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查或臨床病史獲得，采用二分法(有或無(wú)攝入牛乳)進(jìn)行評(píng)估。數(shù)據(jù)使用STATA SE/11軟件(StataCorp, College Station, Tex) 和GraphPad Prism軟件(version 7; GraphPad Software, La Jolla, Calif)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 受試者的人口基線(xiàn)特征和臨床資料

與對(duì)照組比較，EoE組涵蓋的年齡范圍更廣，但兩組患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)和哮喘史方面的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)，與該病男性患病率較高相一致，在EoE隊(duì)列中男性患兒比例較大。兩組均以白種人為主，但對(duì)照組與EoE組相比，非白種人受試者的比例更高。EoE患兒總IgE水平、鼻炎病史、濕疹病史和食物過(guò)敏史的比例均高于對(duì)照組。

所有入組的EoE患者均處于活動(dòng)期，即在納入研究時(shí)有至少1例食管活檢標(biāo)本中嗜酸性粒細(xì)胞≥15個(gè)/ HPF，其中嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)平均峰值的中位數(shù)(四分位數(shù))為40(25，60)個(gè)/ HPF，6例EoE患者使用過(guò)質(zhì)子泵抑制劑治療[23]。

EoE組中最常見(jiàn)的消化道癥狀是吞咽困難，其次是腹痛、嘔吐、返流和食物嵌塞感。20% EoE患者有EoE或反流癥狀的家族史，約75%的EoE患者(n=53/71)有牛乳攝入史，而對(duì)照組為98%。在18例避免牛乳攝入的EoE患者中，2例僅避免牛奶，16例避免牛奶和至少1種其他食物。評(píng)估對(duì)照組兒童的關(guān)于臨床病史的問(wèn)卷中未包含消化道癥狀有關(guān)項(xiàng)目，并且對(duì)照組未曾進(jìn)行食道鏡檢查。

表1 EoE組和對(duì)照組的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)/臨床數(shù)據(jù)總結(jié)

2.2 對(duì)EoE患者抗食物分子變應(yīng)原sIgG4的篩選

為了解EoE患者對(duì)食物變應(yīng)原產(chǎn)生IgG4的本質(zhì)，我們分析一部分EoE患者(n=30/71)的血清標(biāo)本。從血清中測(cè)定抗21種食品變應(yīng)敏原的sIgG4，這21種變應(yīng)原分別來(lái)自牛乳、小麥、花生、大豆和雞蛋(表1)?？笲os d 4、Bos d 5、Bos d 8和麩質(zhì)的sIgG4滴度最高，雖然其他食物蛋白對(duì)應(yīng)的sIgG4也很常見(jiàn)(圖1)。Bos d 4和 Bos d 5都是純化蛋白，而B(niǎo)os d 8和麩質(zhì)都是多種相近蛋白質(zhì)的混合物。因?yàn)橐阎古Ｈ榈鞍譻IgG4滴度較高，且牛乳常被報(bào)道為與EoE最常見(jiàn)的相關(guān)食物[7-8]，故后續(xù)的分析集中于對(duì)牛乳的免疫應(yīng)答方面。我們采用純化的蛋白偶聯(lián)瓊脂糖珠的結(jié)果(本文在線(xiàn)內(nèi)容，圖E1，A)進(jìn)行抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的特異性IgG4檢測(cè)。定量準(zhǔn)確性是

圖 1 在30例EoE患兒測(cè)量5種抗牛乳、2種抗小麥、5種抗花生、3種抗大豆、3種抗雞蛋蛋白、以及抗α-gal(牛乳相關(guān))、抗麥谷蛋白(小麥相關(guān))、抗麩質(zhì)(小麥相關(guān))的sIgG4水平(幾何均數(shù)[95% CI])虛線(xiàn)以下為陰性值(<0.07 μg/ml)

由3種不同的抗IgG4單克隆抗體通過(guò)放射免疫分析法比較驗(yàn)證(圖E1，B)，進(jìn)一步的研究利用瓊脂糖結(jié)合G蛋白或單克隆抗體(分別和IgG或IgG4結(jié)合)，表明EoE患者的IgG反應(yīng)蛋白主要是IgG4(本文在線(xiàn)內(nèi)容，圖E2和表E2)。

2.3 EoE組和對(duì)照組的抗牛乳蛋白sIgG4進(jìn)行標(biāo)記

接下來(lái)對(duì)牛乳蛋白的研究進(jìn)行擴(kuò)展，共納入71例EoE組患者和210名對(duì)照者。盡管在兩組中幾乎所有受試者皆可檢測(cè)到至少1種抗牛乳蛋白抗體(≥97%)，但EoE組抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的sIgG4水平顯著高于對(duì)照組(P<001)(表2)。

我們還比較兩組間抗牛乳蛋白sIgG4的水平作為評(píng)估受試者產(chǎn)生抗牛乳sIgG4功能的評(píng)估方法(表1)，不論對(duì)照組兒童是否牛乳致敏(圖2)，牛乳致敏的EoE患兒抗Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8的sIgG4水平顯著高于對(duì)照組，而不并發(fā)牛奶致敏的EoE患兒與非致敏對(duì)照組相比，血清抗Bos d 5 and Bos d 8的sIgG4水平僅達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。作為額外對(duì)照，牛乳致敏的EoE患兒還與另一個(gè)隊(duì)列(n=10)進(jìn)行抗牛乳蛋白sIgE 和 sIgG4水平的比較，該隊(duì)列患者食用牛乳后可產(chǎn)生IgE介導(dǎo)全身變態(tài)反應(yīng)(本次未攝入乳制品)。結(jié)果顯示EoE 患兒的sIgG4水平比后者顯著升高(本文在線(xiàn)內(nèi)容，表E3)。

由于在EoE患者中抗牛乳蛋白sIgG4的滴度非常高，也許可以直接比較sIgG4與總IgG4量的差異。與對(duì)照組相比，EoE患者的總IgG4水平?jīng)]有顯著差異(圖3E A，本文在線(xiàn)內(nèi)容)。直接測(cè)量抗牛乳蛋白sIgG4受到背景結(jié)合物的技術(shù)問(wèn)題的限制；然而，抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的sIgG4滴度總和可作為牛乳sIgG4滴度的替代測(cè)量法[24]。在EoE組中，這3種抗牛乳蛋白的sIgG4表達(dá)量與總IgG4相比值明顯高于對(duì)照組(P<0.001)(圖3E B)。

表2 EoE組和對(duì)照組抗牛乳蛋白sIgG4抗體滴度分析

圖 2 伴有或無(wú)牛乳過(guò)敏的71例EoE組患者和210名對(duì)照組抗Bosd4、Bosd5和Bosd8的sIgG4水平(幾何均數(shù)(95% CI))虛線(xiàn)以下為不可測(cè)得值(#ND)，不參與幾何均數(shù)運(yùn)輸(Mann-Whitney檢驗(yàn))

2.4 抗牛乳sIgE滴度、IgG4/IgE比值與EoE的關(guān)系

近來(lái)我們的研究報(bào)道，在行食管鏡檢查的兒童中，抗食物IgE抗體，特別是低至中等滴度的抗牛乳sIgE數(shù)值與EoE相關(guān)[12,16,25-27]，還發(fā)現(xiàn)抗食物sIgE水平通?？稍贓oE患者中檢測(cè)得到(76%)。有趣的是，對(duì)照組中的36%患者亦可檢測(cè)到抗牛乳sIgE(表1)。盡管大多數(shù)EoE患兒抗牛乳sIgE的濃度較低(0.10～2.0 U/ml)，但EoE 組的抗體濃度仍較對(duì)照組高。我們還對(duì)71例EoE 患者和210名健康對(duì)照者的血清進(jìn)行了抗牛奶特異成分Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8 的sIgE檢測(cè)。使用同樣的牛奶提取物，EoE組這3種抗牛奶成分的sIgE陽(yáng)性率都比對(duì)照組高(表3)。

我們使用廣泛認(rèn)可的換算方式1 U=2.42 ng將sIgE的單位換算為μg/ml，并在可測(cè)得sIgG4 和 sIgE兩者的樣本中計(jì)算抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的sIgG4/sIgE比值。正如所設(shè)想的，EoE組中抗Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8的sIgG4和sIgE的共同表達(dá)比例顯著高于對(duì)照組(P<0.001,表4)。無(wú)論在實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，血清中抗同種牛乳蛋白的sIgG4絕對(duì)值普遍比IgE絕對(duì)值高10 000倍。

接下來(lái)，我們分析抗牛乳蛋白sIgG4與EoE關(guān)系的強(qiáng)弱，EOE與對(duì)照組抗3種牛乳蛋白的中高滴度(≥1.0 μg/ml)以及高滴度(≥10 μg/ml )sIgG4抗體的比值比(odds ratios，ORs)均大于1(表5)，最強(qiáng)的是高滴度抗Bos d 8的sIgG4(OR，8.4；95%CI：4.3～15)，但值得注意的是，這些數(shù)值與抗牛乳蛋白sIgE對(duì)應(yīng)的OR值相比沒(méi)有顯著差異。

2.5 根據(jù)年齡、性別和有無(wú)乳制品攝入調(diào)整后的抗牛乳sIgG4水平

與對(duì)照組相比，EoE隊(duì)列在年齡和飲食上有較大異質(zhì)性，且男性比例更高(表1)。因此，我們?cè)贓oE和對(duì)照人群的亞組中評(píng)估抗牛乳sIgG4應(yīng)答。此外，我們根據(jù)年齡、性別和攝入牛乳的差異進(jìn)行回歸分析。首先，我們集中于EoE 組10～18歲(中位數(shù)，14歲)的樣本，因?yàn)樵搧喗M的年齡與Viva 項(xiàng)目隊(duì)列中的樣本更接近(中位數(shù)12.9歲)(圖3)。在這個(gè)亞組中有29例男孩和15例女孩，大多數(shù)有乳制品攝入史(分別為86%和80%)。在攝入或避免攝入乳制品的樣本中抗牛乳蛋白sIgG4水平?jīng)]有明顯差異，盡管這分析中該年齡組無(wú)乳制品攝入的樣本量較小。與對(duì)照組相比，EoE組中男孩亞組和女孩亞組抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的sIgG4滴度均較高(圖3)。有趣的是，在EoE組中，男孩抗牛乳蛋白sIgG4水平較女孩高，但只有Bos d 5組有顯著差異(P=0.009)。然而在對(duì)照組中，男孩和女孩之間有相反的趨勢(shì)。與此相適應(yīng)的是，關(guān)于年齡和乳制品攝入的Logistic回歸分析表明，在男孩組中高滴度的sIgG4與EoE關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)。例如，在男孩組中這3種牛乳蛋白調(diào)整后的OR值均大于20(表E4)。與之相反，女孩組的3種牛乳蛋白的OR值均小于10，且在Bos d 5組中OR值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表6)。然而，在整個(gè)大樣本中，性別分組分析并沒(méi)有差異。

EoE隊(duì)列中2～9歲年齡組包括20例男生和7例女生，其中37%的患者避免所有乳制品攝入，其抗Bos d 5 和 Bos d 8的sIgG4滴度明顯較低，并且Bos d 4的滴度更低(本文在線(xiàn)內(nèi)容，圖 E4)。然而，值得注意的是，在10個(gè)避免攝入乳制品的受試者中均可測(cè)得抗Bos d 5和Bos d 8的sIgG4滴度，盡管在目前的研究中對(duì)照樣本的年齡與幼兒不相匹配，但比最近一個(gè)年齡為2歲的隊(duì)列樣本的sIgG4應(yīng)答的研究有更明顯上述趨勢(shì)[28]，而總IgG4水平不受性別、年齡或有無(wú)牛乳攝入的干擾。

我們最初的實(shí)驗(yàn)表明，EoE患兒抗麩質(zhì)sIgG4水平升高(本文在線(xiàn)內(nèi)容,圖E5)。EoE組男孩亞組抗麩質(zhì)的OR值(根據(jù)年齡和攝入乳制品調(diào)整)與抗牛乳蛋白抗體相比較低(OR值7.4，95%CI：3.0～18.0)，而在女孩亞組中相關(guān)性不顯著(OR值2.7，95%CI：0.8～9.0)。在評(píng)估抗牛乳蛋白sIgE的量是否與性別分層或根據(jù)年齡和乳制品攝入校正后相關(guān)時(shí)發(fā)現(xiàn)，和sIgG4的結(jié)果相反，抗牛乳蛋白(同樣提取方式)的sIgE在校正年齡和乳制品攝入等因素后與EoE的相關(guān)性并未加強(qiáng)，性別因素的影響也偏小(本文在線(xiàn)內(nèi)容,圖E6和表E4)。

2.6 在無(wú)牛乳飲食中患者抗牛乳蛋白sIgG4的改變

最后，我們對(duì)13例在飲食中剔除牛奶的EoE患兒體內(nèi)抗牛乳蛋白sIgG4水平的變化進(jìn)行檢測(cè)[15]，發(fā)現(xiàn)在無(wú)牛乳飲食的6至8周后抗 Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8的sIgG4水平平均下降40%～60%(本文在線(xiàn)內(nèi)容,圖E4和圖E7)。所有受試者的sIgG4水平均下降，包括恢復(fù)飲食者(n=8)和未恢復(fù)飲食(n=5)者。盡管sIgG4水平下降與去除牛乳飲食相關(guān)，但與對(duì)照組相比，EoE患兒的平均水平仍然較高。

表3 EoE組和對(duì)照組抗牛乳蛋白sIgE樣本量和水平

表4 sIgG4/sIgE比值分析

圖 3 根據(jù)性別和有無(wú)乳制品攝入，比較10～18歲EoE患兒和年齡匹配對(duì)照組中抗Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8的sIgG4水平[幾何均數(shù)(95% CI)]差異。虛線(xiàn)以下為不可測(cè)得值和全組總數(shù)比值(#ND/T)

表5 EoE患者和抗牛乳蛋白sIgE和sIgG4滴度的相關(guān)性分析

表6 高滴度抗牛乳蛋白sIgG4(≥10 μg/ml)與EoE的關(guān)系

圖 4 將無(wú)牛乳飲食6～8周后的EoE患者(n=13)抗Bos d 4、Bos d 5和 Bos d 8的sIgG4水平與對(duì)照組(n=210)基線(xiàn)水平相比使用威氏配對(duì)檢驗(yàn)和曼-惠特尼檢驗(yàn)分析

3 討論

盡管EoE患者中抗牛乳蛋白和其他食物的sIgE水平改變很常見(jiàn)，但滴度普遍較低，但現(xiàn)有的證據(jù)無(wú)法明確EoE與IgE之間的關(guān)系[12,16,26-27]。本研究的數(shù)據(jù)表明，EoE患兒中抗牛乳蛋白sIgG4比對(duì)照隊(duì)列中的兒童滴度高。據(jù)我們所知，在EoE患兒中抗食物變應(yīng)原的sIgG4水平普遍最高，否則有其他抗原的sIgG4是最高的。高IgG4水平與IgE的關(guān)系是一種血清學(xué)模式，常表現(xiàn)為變應(yīng)原耐受，包括針對(duì)變應(yīng)原免疫治療后的免疫應(yīng)答、遭受多次蜂蜇或養(yǎng)寵物貓[29-33]。因此，EoE挑戰(zhàn)了關(guān)于IgG4的傳統(tǒng)觀點(diǎn)：高滴度sIgG4顯然與對(duì)牛乳耐受無(wú)關(guān)。

在未過(guò)敏的受試者中，IgG4在血清IgG中所占比例較小，然而，血清IgG4的正常值(0.01～2.00 mg/mL)提示其與其他IgG亞類(lèi)相比有更大的可變性[34]。用不同的分子抗體對(duì)IgG4上的特異性重鏈表位進(jìn)行測(cè)定可得到sIgG4和總IgG4的準(zhǔn)確定量[35]。此外，我們發(fā)現(xiàn)抗牛乳蛋白sIgG4在總IgG4中比例較大，并且抗Bos d 4、 Bos d 5和Bos d 8的sIgG4/sIgE比值通常是10000∶1或更大。相反，食物過(guò)敏和高滴度sIgE水平相關(guān)，常合并低滴度的sIgG4[36-38]。生物學(xué)上，IgG4在變應(yīng)原耐受的過(guò)程中具有若干特征，包括Fab片段交換引起的單一功能性、無(wú)法激活補(bǔ)體和對(duì)大多數(shù)Fcγ受體的低親和力[17,39-41]。因此，初步研究顯示，成人EoE患者的血清和食管中有高水平的食物sIgG4[13]。雖然隨后的研究證實(shí)了這些觀察[19，42]，但使用全食物提取物而不是純化蛋白所得的sIgG4檢測(cè)值是半定量結(jié)果，也未與同一類(lèi)食物的sIgE水平進(jìn)行比較。

在變態(tài)反應(yīng)性疾病研究中，選擇對(duì)照組有一定挑戰(zhàn)性，因?yàn)椤白儜B(tài)反應(yīng)”在人群中很常見(jiàn)。因此，僅是選擇“非變態(tài)反應(yīng)者”或“非致敏者”作為對(duì)照就會(huì)除外大部分人群，選擇接受過(guò)食管鏡檢查且不滿(mǎn)足EoE診斷標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照受試者也有一定困難[13,19,42]。本研究的對(duì)照組是從一個(gè)患者尚未出生即入組的隊(duì)列中選取210例幼兒，變態(tài)反應(yīng)史和入組條件無(wú)關(guān)[20]。病例對(duì)照數(shù)據(jù)可用于評(píng)估抗食物sIgG4、sIgE抗體與EoE之間的相關(guān)性，如EoE 患者中抗Bos d 8的高滴度(≥10 μg/ml)sIgG4的OR值為8.4(95%CI：4.3～15.0)。有趣的是，在調(diào)整了年齡和牛乳攝入量后，男孩組IgG4水平與和EoE之間的相關(guān)性較女孩組更強(qiáng)，所有年齡段的EoE患者中男性比例更高[2]。

抗牛乳IgG4與EoE的OR值有意義時(shí)提示sIgG4可能與EoE患者的炎癥和纖維化有關(guān)，但這并不能說(shuō)明EoE與IgG4本身即有相關(guān)性，而是IgG4極有可能是導(dǎo)致EoE免疫應(yīng)答的一個(gè)組成部分。一種可能性是，抗牛乳sIgG4是EoE患者的附加反應(yīng)，可能與異常的Th2或調(diào)節(jié)性T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)[43-44]，并且sIgG4不足以誘發(fā)EOE的支持點(diǎn)在于10%的對(duì)照組樣本也具有高滴度的抗牛乳蛋白sIgG4，這一比值遠(yuǎn)大于計(jì)算患病率時(shí)全國(guó)范圍內(nèi)隨機(jī)得到的EoE比例[2]，但是也不能完全排除IgG4的致病作用。例如，EOE與IgG4相關(guān)疾病具有共同的特征[13,42,45-46]，這兩種疾病皆為男性好發(fā)和糖皮質(zhì)激素治療有效，并且在EoE患者的食管中存在IgG4相關(guān)疾病的標(biāo)志，即IgG4陽(yáng)性漿細(xì)胞和IgG4顆粒狀沉積[13,42]。 IgG4致病的可能機(jī)制涉及細(xì)胞外免疫復(fù)合物的形成，促成這種情況的原因可能是sIgG4抗體水平主要限于單一變應(yīng)原(變應(yīng)原復(fù)合物)，并且在Fab片段交換前組織中就存在高濃度對(duì)應(yīng)變應(yīng)原，這與我們觀察到的35%的EoE患者其抗牛乳蛋白sIgG4水平占總IgG4>10%的情況一致?？傊?，究竟高滴度sIgG4是一個(gè)附加現(xiàn)象還是參與EoE的炎癥機(jī)制將是未來(lái)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。

無(wú)論IgG4在EOE中的作用如何，這種高滴度的抗體亞類(lèi)研究可能會(huì)為變應(yīng)原耐受失敗的原因提供線(xiàn)索。IgG4 的B細(xì)胞種類(lèi)轉(zhuǎn)換重組(class-switch recombination，CSR)與IgE CSR過(guò)程中均有相同的因子參與，如IL-4和IL-13，然而，IgG4還與調(diào)節(jié)B和T細(xì)胞分泌的高水平IL-10有關(guān)[32,47-48]。EoE患者食管內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的TGF-β1水平升高[49-50]，TGF-β1可抑制IgE CSR，并促進(jìn)肥大細(xì)胞聚集和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。T細(xì)胞在CSR中起核心作用，因此T細(xì)胞活化或發(fā)育中的上游缺陷參與了EoE的發(fā)生及IgG4的產(chǎn)生。

EoE患者血清中抗牛乳蛋白sIgG4升高引起我們對(duì)幾個(gè)與診斷相關(guān)問(wèn)題的關(guān)注，一個(gè)是抗牛乳sIgG4水平是否可作為EoE的診斷或病情監(jiān)測(cè)的生物標(biāo)志物問(wèn)題，這顯然需要前瞻性的研究證據(jù)支持，且在男孩組和女孩組之間的ORs差異提示我們應(yīng)考慮性別差異。此外，本研究結(jié)果也許可解釋關(guān)于食物sIgE水平與EoE相關(guān)性的研究結(jié)果，多個(gè)ISAC相關(guān)的研究結(jié)果與ImmunoCAP的結(jié)果相矛盾。例如，最近2個(gè)使用ISAC檢測(cè)成人EoE患者血清中抗牛乳蛋白sIgE的研究證據(jù)微弱[14,26]。過(guò)去我們?cè)诔扇撕蛢和疎oE患者中報(bào)道了這一現(xiàn)象，但發(fā)現(xiàn)其中許多樣本使用ImmunoCAP法后可產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果[16]。與ISAC 相比，ImmunoCAP可多容納約106倍變應(yīng)原[51]。 已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)成人花粉過(guò)敏者若接受花粉皮下免疫治療則可抑制ISAC信號(hào)[29]。本研究中極高的抗牛乳蛋白sIgG4/sIgE比值可解釋為何在EoE患者中使用sIgE芯片有陰性結(jié)果的問(wèn)題[14,15,26,52]。

本研究的局限性在于許多其他食物致敏原尚未明確，無(wú)法用于商業(yè)化檢驗(yàn)。此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，在排除本研究相關(guān)的6種食物后仍有抗其他食物蛋白質(zhì)的IgG4，特別是在小麥中，我們發(fā)現(xiàn)有高水平的抗麩質(zhì)sIgG4但沒(méi)有抗Tri a 19 或其他醇溶蛋白的sIgG4。小麥?zhǔn)且环N復(fù)雜的混合物，包含許多可能與EoE相關(guān)的致敏原。此外，小麥變應(yīng)原可以與草及其他食物存在交叉反應(yīng)[53-55]。盡管我們認(rèn)識(shí)到在EoE患者中有高水平的抗麩質(zhì)sIgG4，但目前這些結(jié)果難以與牛乳一樣從分子水平上解釋。此外，EoE與抗麩質(zhì)sIgG4水平之間的關(guān)聯(lián)也不如與抗牛乳蛋白sIgG4的強(qiáng)。

本研究的另一個(gè)局限性是在對(duì)照組中沒(méi)有評(píng)估胃腸道癥狀，因?yàn)檎{(diào)查問(wèn)卷中未設(shè)立相關(guān)項(xiàng)目。此外，在對(duì)照隊(duì)列中進(jìn)行食管鏡檢查和活檢也是不可行的。也許對(duì)照組中存在患有EoE的兒童，但從本病的患病率方面考慮可能性極低[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)全國(guó)EoE的患病率為100/100 000，即便是本研究對(duì)照組中有EoE的話(huà)可能也不超過(guò)1或2個(gè)。

檢測(cè)特定蛋白的抗體已經(jīng)提供了關(guān)于抗食物IgE的重要信息，本研究用同樣的方法研究發(fā)現(xiàn)，EoE患兒的抗牛乳蛋白sIgG4滴度大于未經(jīng)選擇的對(duì)照隊(duì)列。研究結(jié)果還表明，男孩組的抗牛乳蛋白sIgG4水平高于女孩組，而EoE組中兩亞組差異大于對(duì)照組。今后關(guān)于抗食物sIgG4抗體的研究中應(yīng)進(jìn)一步探索EoE患者免疫應(yīng)答的根源，并尋找診斷該病的非侵入性生物標(biāo)志物。

本研究的主要信息

·抗牛乳蛋白IgG4抗體在EoE患兒和未經(jīng)選擇的對(duì)照隊(duì)列中普遍存在。

·主要抗牛乳蛋白的高滴度抗體(抗Bos d 4、Bos d 5 和 Bos d 8)及EoE有很強(qiáng)的相關(guān)性。

·EoE男性好發(fā)，本研究中高滴度抗牛乳蛋白IgG4抗體的OR值在男性EoE患兒中極高。

參考文獻(xiàn)請(qǐng)見(jiàn)原文：

J Allergy Clin Immunol, 2018, 142: 139-148

附：在線(xiàn)內(nèi)容

1 方法

1.1 對(duì)照組受試者的入組標(biāo)準(zhǔn)和細(xì)節(jié)及二次分析的組別

在1999到2002年間，研究者從哈佛大學(xué)萬(wàn)加德醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)的8個(gè)產(chǎn)科辦公室招募女性進(jìn)入Viva項(xiàng)目，該協(xié)會(huì)為一個(gè)位于馬薩諸塞州東部的多學(xué)科實(shí)踐小組E1。排除標(biāo)準(zhǔn)包括多胎妊娠、招募時(shí)孕齡≥22周，無(wú)法用英文回答問(wèn)題和計(jì)劃在分娩前離開(kāi)開(kāi)展研究地區(qū)者。對(duì)照組(孕婦的孩子)沒(méi)有與疾病狀態(tài)相關(guān)的排除標(biāo)準(zhǔn)。在2 128個(gè)嬰兒樣本中，有1 038名孩子在青少年早期[平均年齡：12.9(12.5～13.4歲)]接受回訪，其中有773名提供了血液標(biāo)本，有647個(gè)血清標(biāo)本用于IgE測(cè)定。我們隨機(jī)選擇這647個(gè)標(biāo)本中的210個(gè)進(jìn)行檢測(cè)。

在來(lái)自全國(guó)兒童醫(yī)院的EOE患者中，有13名患兒還參加了一項(xiàng)評(píng)估超過(guò)6至8周無(wú)牛乳飲食效果的研究E2。按照流程于進(jìn)食前后收集患兒血清，并測(cè)定抗牛乳蛋白sIgG4，以進(jìn)行二次分析。為了比較，我們測(cè)量了10名有牛奶過(guò)敏的兒童血清中的抗牛乳sIgG4滴度，該樣本定義為攝入牛奶的1 h內(nèi)出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)的變態(tài)反應(yīng)史，且有≥0.35 U/ml的抗牛乳sIgE抗體滴度。這些血清收集已獲得在弗吉尼亞大學(xué)注冊(cè)的知情同意。

1.2 IgG4吸附試驗(yàn)

1.2.1 IgG4吸附試驗(yàn)：將10 mg nBos d 4和nBos d 5(Sigma-Aldrich)耦聯(lián)于1 g溴化氰活化凝膠4B(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，加入PBS制成質(zhì)量濃度50%懸浮劑。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中采用模擬珠將人血清白蛋白耦合到凝膠上。等體積的3份本研究EoE患者血清(約0.5 ml)和每個(gè)凝膠珠分別置于離心管中，在垂直旋轉(zhuǎn)器上4 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。離心凝膠珠，并檢測(cè)血清中Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8的sIgG4水平。計(jì)算Bos d 4、Bos d 5吸收值和模擬吸收值的百分比差異，作為檢測(cè)后剩余的IgG4標(biāo)志。

1.2.2 Bos d 4吸附試驗(yàn)：選擇性地去除抗Bos d 4 的sIgG4，而不是抗Bos d 5 和 Bos d 8的sIgG4。類(lèi)似地，Bos d 5吸附是選擇性去除抗Bos d 5的sIgG4(圖E1，A)。這些結(jié)果表明，ImmunoCAP IgG4檢測(cè)法對(duì)于Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8而言是特異的。

表 E1 現(xiàn)有研究的變應(yīng)原總結(jié)(來(lái)自www.allergen.org)

1.2.3 Bos d 4吸附試驗(yàn)：選擇性地去除抗Bos d 4 的sIgG4，而不是抗Bos d 5 和 Bos d 8的sIgG4。類(lèi)似地，Bos d 5吸附是選擇性去除抗Bos d 5的sIgG4(圖E1，A)。這些結(jié)果表明，ImmunoCAP IgG4檢測(cè)法對(duì)于Bos d 4、Bos d 5和Bos d 8而言是特異的。

1.3 利用分子變應(yīng)原的特異性IgG固相放射免疫分析法

使用固相放射免疫分析法測(cè)定抗nBos d 4 和 nBos d 5(Sigma Aldrich)的特異性IgG、特異性IgG1和sIgG4水平。使用氯胺-T放射性碘125標(biāo)記變應(yīng)原，使用Invitrogen(Camarillo, Calif)的重組蛋白G -瓊脂糖4B綴合物測(cè)量IgG水平。IgG4測(cè)定：使用10 mg的抗人IgG4單克隆抗體clone RJ4(Abingdon Health, York, United Kingdom)、MH164-4(San- quin Blood Supply, Amsterdam, The Netherlands)或HP6023(Sigma-Al- drich)與1g溴化氰活化凝膠4B偶聯(lián)，IgG1的測(cè)定則使用抗人IgG1單克隆抗體clone HP-6001(Sigma-Aldrich)。

于PBS中加入0.25 ml質(zhì)量濃度50%的懸浮瓊脂糖培養(yǎng)基、體積分?jǐn)?shù)0.3%人血清蛋白、0.5 ml緩沖液(在PBS中加入0.01 mol/L EDTA，0.3%人血清蛋白，0.05% NaN3，0.2% Tween-20)以及10 ml血清到2 ml的聚苯乙烯試管中。室溫下將混合物置于垂直旋轉(zhuǎn)器里孵育4 h。將懸浮液離心并洗滌(在0.1% Tween-20的PBS中)5次，加入0.5 ml緩沖液和50 ml放射性標(biāo)記的變應(yīng)原(在含有0.3%人血清白蛋白的PBS)，懸浮液離心4 h后再次洗滌。用γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量試管，并產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量。結(jié)果以單位每毫升表示，基礎(chǔ)值為5 U/ml。

圖 E1 A.3例EoE患兒的抗Bos d 4 和 Bos d 5抗體吸附試驗(yàn); B. 使用3種不同的抗人IgG4單克隆抗體(HP-6023、MH164-4和RJ4)和16例EoE患兒的血清為材料，ImmunoCAP檢測(cè)測(cè)定抗Bos d 4 and Bos d 5的sIgG4，固相放射免疫分析(RIA)測(cè)定IgG4，并分析兩個(gè)定量結(jié)果的相關(guān)性

我們使用16例EOE患者的血清標(biāo)本比較抗Bos d 4和Bos d 5IgG4 的Immuno CAP測(cè)定法和固相放射免疫分析法的定量準(zhǔn)確性(圖 E1, B)，發(fā)現(xiàn)使用單克隆抗體clone HP-6023測(cè)定抗Bos d 4的sIgG4的兩種方式有密切的定量相關(guān)性(rs=50.97,P< 0.001)，使用3種不同單克隆抗體測(cè)定抗Bos d 5的sIgG4也同樣相關(guān)，這3種抗體分別為HP-6023(rs=50.92,P<0 .001)、MH164-4(rs=50.89，P<0 .001)和RJ4 (rs=50.86,P<0.001)。

放射免疫分析結(jié)果顯示，16例患者中有11名測(cè)得了抗Bos d 4 的sIgG4，而使用HP-6023和 MH164-4測(cè)得所有患者的抗Bos d 5的sIgG4，使用RJ4測(cè)得了16例中的14例患者。除了抗Bos d 4和Bos d 5的sIgG4，我們還測(cè)定了特異性IgG和IgG1抗體。我們明確了IgG1和IgG4亞類(lèi)在抗Bos d 4和Bos d 5的IgG抗體中的占比(表 E2)，并在16名EoE患者中確認(rèn)抗牛乳蛋白IgG抗體主要為IgG4。

1.4 總IgG4測(cè)定

總IgG4的ImmunoCAP測(cè)定(IgA/IgG Calibrator ImmunoCAP)技術(shù)(非標(biāo)記使用)是基于使用抗κ和抗λ輕鏈單克隆抗體在固相上從血清中捕獲抗體，然后使用熒光標(biāo)記的抗人IgG4單克隆抗體檢測(cè)結(jié)合IgG4。檢測(cè)前在IgA/IgG樣本稀釋中將血清稀釋至1∶50至1∶100(必要時(shí)稀釋比例更高)，值得注意的是，ImmunoCAP儀器有余外的1∶100稀釋?zhuān)虼俗罱K稀釋度為5 000～10 000倍。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示良好的線(xiàn)性稀釋度(圖 E2，A)，且固相結(jié)合能力至少可以在處理超過(guò)128倍的IgG1抗體時(shí)不降低IgG4定量(圖 E2, B)。另外，我們用比濁法和Immuno CAP試驗(yàn)測(cè)定53名受試者的血清總IgG4水平，發(fā)現(xiàn)這些方法之間有很好的相關(guān)性[rs=5 0.98(0.97～0.99)，P< 0.001；圖 E2, C]。ImmunoCAP測(cè)定總IgG4的平均變異系數(shù)為3.4%。

圖 E2 A.總IgG4測(cè)定：在3個(gè)隨機(jī)血清樣本中予線(xiàn)性稀釋(2倍)測(cè)得總IgG4數(shù)值;B. IgG1濃度增加時(shí)測(cè)定總IgG4;C.使用ImmunoCAP和比濁法測(cè)定53名受試者總IgG4數(shù)值，并比較兩種定量方法的相關(guān)性(Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù))

表 E2 抗牛乳特異性IgG1和IgG4在EoE患者所產(chǎn)生的sIgG的比例

表 E3 牛乳致敏患兒的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)/臨床數(shù)據(jù)(n=10)

圖 E3 A.總IgG4滴度(幾何均數(shù)(95% CI)) B. 在71例EoE患兒和210名對(duì)照受試者(排除無(wú)sIgG4陽(yáng)性結(jié)果的2例EoE患兒和3名對(duì)照受試者)中抗牛乳sIgG4滴度(Bos d 4+Bos d 5+ Bos d 8的sIgG4滴度總和)占總IgG4的百分比[幾何均數(shù)(95% CI)]；使用曼-惠特尼檢驗(yàn)分析

表 E4 根據(jù)性別分層分析EoE患兒和抗牛乳蛋白sIgE水平之間的關(guān)系

圖 E4 根據(jù)有無(wú)攝入乳制品對(duì)小于10歲的EoE患兒進(jìn)行分組，分析抗牛乳sIgG4水平的性別差異使用曼-惠特尼檢驗(yàn)分析

圖 E5 A.71例EoE患者和210名對(duì)照受試者抗麩質(zhì)sIgG4水平[幾何均數(shù)(95% CI)];B.10～18歲EoE患兒按性別分層后抗麩質(zhì)sIgG4的水平，以及其與對(duì)照組的差異。使用曼-惠特尼檢驗(yàn)分析;虛線(xiàn)以下為整組的陰性值

圖 E6 EoE患兒和對(duì)照組抗牛乳提取物的sIgE水平

圖 E7 6～8周無(wú)牛乳飲食后EoE患者(n=13)的sIgG4水平變化

參考文獻(xiàn)請(qǐng)見(jiàn)原文：

J Allergy Clin Immunol, 2018, 142:139-148；在線(xiàn)內(nèi)容：www.jacionline.org