張錦豐，李 亮，楊權(quán)烈，吳靜娜

(梅州市人民醫(yī)院化療科，廣東 梅州 514031)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是臨床常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后較差[1]。P27Kip1是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitor, CKI)之一，研究[2]表明P27Kip1蛋白的表達(dá)異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。然而在NSCLC的研究中，尚不能確定P27Kip1是一種有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法檢測43例NSCLC組織和27例肺良性病變組織中P27Kip1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)合臨床、病理、隨訪資料，了解P27Kip1蛋白的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2004年3月至2008年12月在我院經(jīng)手術(shù)切除并病理確診的43例NSCLC石蠟標(biāo)本，所有患者術(shù)前未行放、化療，隨訪資料完整。其中男30例，女13例；年齡23～80歲,中位年齡59歲；腺癌23例，鱗癌20例；有吸煙史者20例，無吸煙史者23例；根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合會(huì)制訂的分期標(biāo)準(zhǔn)：T14例、T230例、T38例、T41例；N030例，N1～213例；M043例，M10例；Ⅰ期24例，Ⅱ期10例，Ⅲ期9例，Ⅳ期0例。另選取同期收治的27例肺良性病變作為對照組，其中肺結(jié)核6例，肺大皰8例，肺囊腫5例，真菌性肺炎2例，炎性假瘤2例，肺纖維化、支氣管擴(kuò)張、黏液腺瘤、肺膿腫各1例。

1.2主要試劑P27Kip1兔抗人單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司，SABC免疫組化染色試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3檢測方法[3]采用鏈酶親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)(streptavidin biotin-peroxidase complex method，SABC)進(jìn)行免疫組化染色，主要步驟如下：常規(guī)脫蠟，水化；檸檬酸熱抗原修復(fù)；體積分?jǐn)?shù)3% H2O2室溫孵育；滴加正常山羊血清封閉液即用液；滴加臨時(shí)配制稀釋好的一抗；滴加二抗即用液；滴加SABC即用液；滴加DAB顯色液，自來水及時(shí)終止染色；蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。用已知陽性(宮頸癌)切片作陽性對照,用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4結(jié)果判定[4]P27Kip1蛋白陽性著色為粗細(xì)不一的棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)。雙盲法觀察結(jié)果，根據(jù)顯色程度和陽性細(xì)胞百分率，分別進(jìn)行評分；將2種評分相加，再除以2，即為最終評分。根據(jù)最終評分結(jié)果，將0、0.5～1.0、1.5～2.0、2.5～3.0分別定為(-)、(+)、(++)和(+++)。其中(+)、(++)和(+++)為陽性，(-)為陰性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0分析處理數(shù)據(jù)，P27Kip1蛋白在NSCLC和肺良性病變組織中表達(dá)情況的比較采用Fisher確切概率法；P27Kip1蛋白與NSCLC各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系分析應(yīng)用2組間比較的秩和檢驗(yàn)；細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中P27Kip1蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析用Spearman等級相關(guān)分析法；根據(jù)壽命表計(jì)算3 a生存率，用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1P27Kip1蛋白在NSCLC和肺良性病變組織中表達(dá)的比較P27Kip1蛋白表達(dá)可見于NSCLC的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核表達(dá)陽性率為9.3%(4/43)，顯著低于肺良性病變組織的44.4%(12/27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013)；細(xì)胞質(zhì)表達(dá)陽性率為48.8%(21/43)，顯著高于肺良性病變的7.4%(2/27)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。P27Kip1蛋白在NSCLC組織中表達(dá)分布結(jié)果分析顯示，僅在細(xì)胞核表達(dá)9.3%(4/43)，僅在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)48.8%(21/43)，兩者均表達(dá)0.0%(0/43)，兩者均不表達(dá)41.9%(18/43)。見圖1。

2.2P27Kip1蛋白表達(dá)與NSCLC患者各臨床病理特征的關(guān)系P27Kip1蛋白細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤部位、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、吸煙狀態(tài)等臨床病理特征均未見明顯關(guān)系(P>0.05)。見表1。

圖1 P27Kip1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)(SABC, ×400)

項(xiàng)目細(xì)胞核陰性陽性陽性率/%P細(xì)胞質(zhì)陰性陽性陽性率/%P性別 男27310.00.813151550.00.819 女1217.77646.2年齡/歲 <6020313.00.371121147.80.888 ≥601915.0101050.0腫瘤部位 左肺15316.70.16310844.40.629 右肺2414.0121352.0病理類型 腺癌2128.70.885111252.20.541 鱗癌18210.011945.0淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 N026413.30.172181240.00.082 N1～21300.04969.2TNM分期 Ⅰ期21312.50.423141041.70.296 Ⅱ～Ⅲ期1815.381157.9吸煙 是18210.00.88511945.00.643 否2128.7111252.2

2.3P27Kip1蛋白表達(dá)與NSCLC患者生存率的關(guān)系P27Kip1蛋白細(xì)胞核表達(dá)陽性和陰性NSCLC患者術(shù)后3 a生存率分別為45.0%和25.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.512)；P27Kip1蛋白細(xì)胞質(zhì)表達(dá)陽性和陰性NSCLC患者術(shù)后3 a生存率分別為33.7%和50.3%，差異無統(tǒng)計(jì)意義(P=0.105)。見圖2、3。

圖2 不同P27Kip1蛋白細(xì)胞核表達(dá)NSCLC患者生存生存曲線

圖3 不同P27Kip1蛋白細(xì)胞質(zhì)表達(dá)NSCLC患者生存曲線

2.4P27Kip1蛋白細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性P27Kip1蛋白在NSCLC細(xì)胞核表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.313，P=0.041)。

3 討論

惡性腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病。細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)取決于正負(fù)調(diào)控因子和各檢查點(diǎn)的功能。負(fù)調(diào)控因子CKI可分為2大家族[5-6]，一類是Cip/Kip家族包括P21Waf1/Cip1、P27Kip1和P57Kip2；另一類是INK4家族包括P15INK4a、P16INK4b、P18INK4c和P19INK4d。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期正負(fù)調(diào)控因子失衡和各檢查點(diǎn)失靈所致的細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)加速和凋亡減少密切相關(guān)。在多數(shù)腫瘤中可見負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)或功能異常。其中P27Kip1在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用及其與腫瘤的關(guān)系倍受關(guān)注。

P27Kip1是1994年P(guān)olyak等[7]在研究細(xì)胞抑制機(jī)制新發(fā)現(xiàn)的一種相對分子質(zhì)量為27 000的細(xì)胞周期抑制蛋白。其cDNA長594 bp，含198個(gè)氨基酸編碼[8]。其氨基端有2個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，介導(dǎo)正調(diào)控因子細(xì)胞周期依賴性激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)活性的抑制[2]。P27Kip1蛋白是一種存在于細(xì)胞中的熱穩(wěn)定蛋白原，其對CDK具有廣譜的負(fù)調(diào)控作用, 主要在細(xì)胞核內(nèi)與Cyclin E/CDK2和Cyclin D1/CDK4復(fù)合物結(jié)合，抑制CDK2和CDK4的蛋白激酶活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期,抑制進(jìn)入S期，阻斷細(xì)胞由靜止期向增殖期過渡[2]。此外，P27Kip1還能促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[9]。

研究[10-16]發(fā)現(xiàn)，P27Kip1蛋白在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)降低或缺失，包括食管癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌以及非小細(xì)胞肺癌等。P27Kip1在腫瘤細(xì)胞中的錯(cuò)誤定位被認(rèn)為是細(xì)胞癌變的機(jī)制之一。當(dāng)P27Kip1蛋白被磷酸化后，可以從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)中的P27Kip1蛋白通過泛素化-蛋白水解體途徑水解失活[17]。此外，某些物質(zhì)可與P27Kip1蛋白結(jié)合并影響其活性，如癌基因c-myc可以誘導(dǎo)Cyclin D表達(dá)，Cyclin D-CDK4/6數(shù)量增多，會(huì)扣留P27Kip1，使之不能與Cyclin E-CDK2結(jié)合，從而失去抑制CDK2蛋白激酶的活性[18]。

本研究中，用免疫組化方法檢測了43例NSCLC組織和27例肺良性病變組織中P27Kip1蛋白的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)P27Kip1蛋白在NSCLC細(xì)胞核表達(dá)陽性率為9.3%，顯著低于肺良性病變的44.4%，這與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致。此外，本研究還觀察到P27Kip1蛋白在NSCLC細(xì)胞質(zhì)表達(dá)豐富(陽性率為48.8%)，明顯高于肺良性病變的7.4%。本研究進(jìn)一步進(jìn)行P27Kip1蛋白細(xì)胞核表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果表明，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中P27Kip1蛋白表達(dá)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，NSCLC細(xì)胞質(zhì)中增多的P27Kip1可能是從細(xì)胞核中泄漏所致；P27Kip1蛋白作為一個(gè)抑癌因子，在NSCLC中表達(dá)下降或失活。

研究[16,20]表明，P27Kip1蛋白的表達(dá)與NSCLC患者腫瘤細(xì)胞分化程度有密切關(guān)系，與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均無明顯關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)P27Kip1蛋白細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)表達(dá)與患者的臨床病理特征未見明顯關(guān)系。因本研究低分化患者病例較少，無法統(tǒng)計(jì)其與P27Kip1蛋白表達(dá)的關(guān)系。

P27Kip1蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系在乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌以及消化道腫瘤已有報(bào)道，在NSCLC的研究中，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，P27Kip1蛋白細(xì)胞核的低表達(dá)與復(fù)發(fā)及不良預(yù)后有關(guān)[20]。我們的研究發(fā)現(xiàn)P27Kip1細(xì)胞質(zhì)表達(dá)陰性的患者生存率有升高的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P27Kip1蛋白表達(dá)與NSCLC生存預(yù)后的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

總之，NSCLC組織中P27Kip1蛋白在細(xì)胞核中表達(dá)減少，細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)增多，其異常定位是NSCLC患者預(yù)后不良的潛在因素之一，兩者的確切關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究和探索。