白小剛 ，蹇 慧 ，王 惠 ，毛 炯 ，夏 昱 ，馮 濤 ，陳 丹 ，李慶慶 ，朱 鏡 ，梁偉波

（1.成都市公安局，四川 成都 610081；2.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

頭屑由角化程度不同的表皮細(xì)胞組成，常見于衣服肩、領(lǐng)部或帽子、頭套等內(nèi)側(cè)，是法醫(yī)日常檢案中能用EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器獲取的一類特殊生物檢材。已有文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道可用頭屑提取DNA并獲得STR分型。EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器，是公安部物證鑒定中心研制的針對脫落細(xì)胞的提取裝置，利用膠帶直接粘取客體表面的脫落細(xì)胞，是現(xiàn)階段實(shí)踐中針對接觸性檢材DNA進(jìn)行提取的主要方法[4-5]。一般情況下常采用這種方法收集衣帽上的皮屑以達(dá)到富集的目的，再提取DNA進(jìn)行分型，但這種方法檢測獲得混合分型結(jié)果的概率較高[6]，為案件分析帶來了一定的困難[7]。如果能對單片狀頭屑進(jìn)行DNA提取并STR分型，可提高透明膠帶所富集樣本的利用率，為案件偵破提供更豐富的證據(jù)信息。

本研究采用透明膠帶和EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器粘取收集頭屑檢材，再分別用鏡下單片狀頭屑DNA提取分型法（簡稱“單片頭屑分析法”）和EZ-tape法提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和STR分型，比較兩種方法的樣本檢出情況。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

EZ4體式顯微鏡、DM2000顯微鏡加裝DFC425 C照相機(jī)（日本Leica公司），無菌顯微鑷［上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠］，EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器（公安部物證鑒定中心），9700型PCR儀、3130xl基因分析儀（美國AB公司）。

Chelex-100（美國 Sigma公司），蛋白酶 K（美國Roche公司），PowerPlex?21試劑盒（美國 Promega公司）。

1.2 樣本采集

兩名志愿者輪流佩戴同一頂帽子各10次，每次5min。采用EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器和透明膠帶分別在帽子內(nèi)側(cè)進(jìn)行粘取取樣。

EZ-tape法：EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器共粘取24份樣本，其中12份在56℃蛋白酶K消化時(shí)進(jìn)行持續(xù)振蕩，12份樣本靜置消化。消化時(shí)間均為1h。

單片頭屑分析法：體式顯微鏡下觀察透明膠帶粘取的樣本，選取單片狀頭屑進(jìn)行取樣，其中24份樣本在56℃蛋白酶K消化時(shí)進(jìn)行持續(xù)振蕩，并按頭屑直徑分為≤200 μm、>200～500 μm、>500 μm 三個(gè)亞組，每組8份樣本。另在鏡下隨機(jī)選取24片頭屑行靜置消化處理。消化時(shí)間均為1h。

取該兩名志愿者的口腔拭子作陽性對照。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)相關(guān)條款規(guī)定。

1.3 STR分型

樣本均用Chelex-100法提取DNA，EZ-tape法體系內(nèi)Chelex-100和蛋白酶K分別為65、5μL，單片頭屑分析法體系內(nèi)Chelex-100和蛋白酶K分別為27、3μL。使用 PowerPlex?21試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，10μL終體系中包含4μL DNA模板，毛細(xì)管電泳獲得STR分型。按照PowerPlex?21試劑盒說明書設(shè)置擴(kuò)增及電泳條件。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件對不同分組樣本獲得準(zhǔn)確分型的樣本數(shù)進(jìn)行Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡觀察

取透明膠帶放置于顯微鏡下觀察可見：單片狀頭屑、多片重疊成塊狀頭屑及衣物纖維等散在分布于鏡下視野中。同一放大倍數(shù)下，三組單片狀頭屑大小示例見圖1。

圖1 三組單片狀頭屑大小示例

2.2 樣本分型結(jié)果

2.2.1 EZ-tape法分型結(jié)果

EZ-tape法所獲24份檢材分型結(jié)果與兩份陽性對照比對：11份樣本發(fā)生漏檢，獲得了單一來源的分型結(jié)果（45.8%），10份獲得混合分型結(jié)果（41.7%），2份樣本未檢出（8.3%），1份樣本僅3個(gè)基因座檢出等位基因（4.2%），詳見表1。11份獲得單一來源分型結(jié)果的樣本中，3份與志愿者1分型結(jié)果一致，8份與志愿者2一致。10份獲得混合分型結(jié)果的樣本中，4份包含兩份陽性對照的全部相應(yīng)等位基因，2份有部分基因座發(fā)生等位基因插入（圖2），4份有部分基因座發(fā)生等位基因丟失，詳見表2。

表1 EZ-tape法獲得分型結(jié)果 （份）

圖2 EZ-tape法獲得混合分型且部分等位基因發(fā)生等位基因插入

表2 EZ-tape法獲得的混合分型結(jié)果 （份）

2.2.2 單片頭屑分析法分型結(jié)果

48份單片狀頭屑分型圖譜與兩份陽性對照比對后獲得的結(jié)果見表3。檢測到完整分型的振蕩樣本數(shù)為11份，靜置消化的為1份；未檢出的振蕩樣本數(shù)為4份，靜置消化為11份；發(fā)生等位基因插入或丟失的振蕩樣本數(shù)為9份，靜置消化的為12份。振蕩與靜置消化處理后的分型準(zhǔn)確數(shù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而振蕩處理的三個(gè)亞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 單片狀頭屑分型結(jié)果 （份）

48份樣本中有36份未能獲得完整分型，12份獲得了完整分型，其中與志愿者1分型結(jié)果相同的為8份，與志愿者2分型結(jié)果相同的為4份。48份樣本中有20份獲得了7個(gè)以上基因座分型結(jié)果，10份在志愿者1的分型中找到，10份在志愿者2的分型中找到；28份獲得少于7個(gè)基因座的分型而難以判斷樣本個(gè)體來源。48份樣本中有2份獲得混合分型結(jié)果，1份在Penta E和D21S11基因座上出現(xiàn)超過2個(gè)等位基因，另1份在CSF1PO基因座上獲得志愿者1、志愿者2的混合分型結(jié)果。

3 討 論

頭屑由角化程度不同的表皮細(xì)胞組成，是日常檢案采集樣本時(shí)常能獲取的一類特殊檢材。LORENTE等[1-3]的研究表明：利用頭屑提取DNA并獲得STR分型具有可行性，作為一種特殊類型的法醫(yī)物證學(xué)檢材，頭屑具有較高的研究價(jià)值。本研究采用直接分析檢測顯微鏡下獲取的單片狀頭屑的方法，同時(shí)與常規(guī)EZ-tape法進(jìn)行比較。用透明膠帶富集頭屑后，借助體式顯微鏡選取單片狀頭屑提取DNA，能夠提高檢材利用率并盡量減少形成混合分型。EZ-tape法檢測中有10份（41.7%）獲得了混合分型結(jié)果，其中6份有部分基因座出現(xiàn)等位基因插入或丟失的情況。與之相比，單片頭屑分析法中48份樣本的分型結(jié)果中：有20份樣本獲得了7個(gè)以上便于判斷樣本來源的基因座分型，其中1份樣本的1個(gè)基因座檢出兩名志愿者的混合分型且無基因座檢出超過2個(gè)等位基因；28份樣本獲得少于7個(gè)基因座的分型而難以判斷樣本個(gè)體來源，其中1份樣本在2個(gè)基因座上檢出超過2個(gè)等位基因。對比可見，單片頭屑分析法檢出混合分型的比例低于常規(guī)EZ-tape法，提示單片頭屑分析法更利于獲得單個(gè)個(gè)體來源的STR分型結(jié)果。此外，常規(guī)EZ-tape法與單片頭屑分析法均檢見等位基因插入或丟失，而發(fā)生等位基因插入或丟失的混合分型結(jié)果會增加結(jié)果分析的難度（圖2）。EZ-tape法檢測的樣本中有11份（45.8%）發(fā)生漏檢，僅獲得單一來源分型結(jié)果。1份樣本用傳統(tǒng)EZ-tape方法僅能進(jìn)行一次DNA提取及STR分型實(shí)驗(yàn)，發(fā)生DNA來源未完全檢出的可能性大，而在實(shí)際案件中，DNA檢驗(yàn)人員是根據(jù)現(xiàn)場勘驗(yàn)人員提供的EZ-tape脫落細(xì)胞粘取器獲得的樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，得出DNA報(bào)告為刑偵人員提供案件線索，未完全檢出DNA來源數(shù)量可能導(dǎo)致案件偵查方向錯誤或嫌疑人“漏網(wǎng)”，比較之下，單片頭屑分析法雖增加了工作量，卻可減少漏檢的概率，可為刑偵人員提供更多、更準(zhǔn)確的線索。

單片狀頭屑屬于一個(gè)個(gè)體，理論上僅能檢出單一個(gè)體來源的DNA分型，本研究中單片狀頭屑仍檢出混合分型，推測其原因可能在于志愿者在多次輪流戴帽的過程中游離DNA附著在頭屑表面。后續(xù)研究可對頭屑表面是否存留游離DNA及其對分型結(jié)果的影響進(jìn)行深入探討。

頭屑僅含微量有核細(xì)胞，可提供的DNA量十分有限。而低拷貝模板樣本分型結(jié)果最主要的缺陷是在擴(kuò)增過程中發(fā)生隨機(jī)變異，易產(chǎn)生隨機(jī)污染[8]，因此，如何有效地從樣本中獲得更多的DNA以提高DNA提取效率，對提高分型成功率十分關(guān)鍵。本研究嘗試探索了蛋白酶K消化過程中樣本振蕩情況與DNA提取效率之間的關(guān)系。在單片頭屑分析法中，振蕩獲得的11個(gè)樣本的完整分型而靜置消化僅獲得1個(gè)樣本的完整分型，二者在分型準(zhǔn)確率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯鲈贒NA提取過程中是否振蕩會影響最終的分型結(jié)果。推測在蛋白酶K消化過程中對樣本進(jìn)行振蕩能更加充分地消化未完全角化的有核細(xì)胞，從而釋放更多的DNA，最終提高STR分型準(zhǔn)確率。

單片頭屑分析法中振蕩的3個(gè)亞組之間，獲得準(zhǔn)確分型的基因座數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，未觀察到頭屑大小對STR分型準(zhǔn)確率存在明顯影響，提示頭屑大小與其包含未角化有核細(xì)胞的數(shù)目之間可能不存在線性關(guān)系，具體還需要擴(kuò)大樣本量后進(jìn)行研究。

本研究結(jié)果提示，直接分析檢測顯微鏡獲取的單片狀頭屑在降低混合樣本檢出率和提高個(gè)體檢出率方面有一定的優(yōu)勢。在采用Chelex-100法提取DNA時(shí)，蛋白酶K消化過程中對樣本進(jìn)行振蕩可提高分型準(zhǔn)確率。而頭屑大小與其含有的DNA量是否呈線性關(guān)系及其與STR分型成功率的關(guān)系還需在今后的研究中進(jìn)一步探索。