范忠誠(chéng) 王琮仁 李 楊

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院骨科，海南 ?？?570208)

骨關(guān)節(jié)炎作為一種退行性疾病，以軟骨細(xì)胞異常減少、基質(zhì)降解增多為主要特性，軟骨細(xì)胞占軟骨組織的5%左右，具有維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、保持軟骨組織完整性的作用，其凋亡增多是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的機(jī)制之一〔1〕。氧化應(yīng)激、物理因素、炎癥因子等都可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，正常情況下，軟骨組織中存在少量的白(IL)-1β，而在關(guān)節(jié)炎患者的軟骨組織中存在大量IL-1β，IL-1β是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的重要因子〔2，3〕。沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)2是一種組蛋白去乙酰酶，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，能夠調(diào)控細(xì)胞能量代謝、增殖、凋亡等過(guò)程，其與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)，在關(guān)節(jié)炎小鼠的軟骨組織中發(fā)現(xiàn)SIRT2 mRNA和蛋白水平均下調(diào)〔4～6〕。本實(shí)驗(yàn)以兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為對(duì)象，研究SIRT2在IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 新西蘭大白兔6只，雌雄不限，2月齡，購(gòu)自長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)動(dòng)物科技服務(wù)部。SIRT2過(guò)表達(dá)慢病毒由北京合生基因構(gòu)建；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco；Ⅱ型膠原酶、MTT、IL-1β購(gòu)自美國(guó)Sigma；DMEM/F12購(gòu)自美國(guó)Thermo；細(xì)胞色素(Cytochrome)C抗體購(gòu)自美國(guó)CTS；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD；Realtime PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購(gòu)自大連寶生物；SIRT2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；胞質(zhì)蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海生工。

1.2兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng) 步驟如下〔7〕：2月齡的新西蘭大白兔，共6只，雌雄不限，購(gòu)自長(zhǎng)沙市開福區(qū)東創(chuàng)動(dòng)物科技服務(wù)部。耳緣靜脈注入空氣將大白兔處死，無(wú)菌條件下取出膝關(guān)節(jié)，于超凈臺(tái)內(nèi)用尖刀刮取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，剪成1 mm3的小塊，加入5 ml 0.25%胰蛋白酶，于37℃恒溫水浴箱內(nèi)消化40 min，離心，棄掉上清，加入5 ml DMEM/F12培養(yǎng)基(含有0.2% Ⅱ型膠原酶)，于37℃恒溫水浴振蕩器150RPM消化6 h，100 μm的無(wú)菌濾篩將殘?jiān)?，?jì)數(shù)，等體積在培養(yǎng)瓶分裝，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，觀察到細(xì)胞貼壁后，每2天換液1次，細(xì)胞達(dá)80%～90%生長(zhǎng)融合時(shí)進(jìn)行傳代。選擇第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.3細(xì)胞分組 取第3代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，分為：Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組共4組，IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加10 ng/ml IL-1β，SIRT2+IL-1β組、NC+IL-1β組細(xì)胞分別為感染SIRT2過(guò)表達(dá)慢病毒和對(duì)照慢病毒的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。Control組、IL-1β組細(xì)胞在培養(yǎng)24 h以后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。慢病毒感染方法簡(jiǎn)述如下：取第3代兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)密度為50%時(shí)，加入慢病毒液，MOI=10，培養(yǎng)3 d后，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于熒光顯微鏡下，觀察GFP綠色熒光表達(dá)情況，細(xì)胞感染效率高于95%，篩選穩(wěn)定感染的細(xì)胞株，給予IL-1β刺激后，用Realtime PCR和Western印跡方法檢測(cè)SIRT2表達(dá)。

1.4Realtime PCR檢測(cè)SIRT2表達(dá) Control組、IL-1β組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)以后，以RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的總RNA，RNA用DEPC水溶解以后，取1 μl的RNA，稀釋200倍，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD260nm/OD280 nm的比值。以RNA作為模板，用cDNA合成試劑盒合成cDNA。取1 μl的cDNA，進(jìn)行Realtime PCR，步驟同Realtime PCR試劑盒，PCR體系為：12.5 μl的2×SYBR Green qPCR混合物，1 μl的上下游引物(5 μmol/L)，1 μl的cDNA模板，添加9.5 μl的ddH2O。引物為：SIRT2正義鏈5′-CAACCTGGAGAAATACCGTCTT-3′，反義鏈5′-CAGTCCTTTTTCCTTCAGCAG-3′。β-actin正義鏈5′-AGTGCGACGTGGACATCCG-3′，反義鏈5′-TGGCTCTAACAGTCCGCCTAG-3′。

1.5Western印跡檢測(cè)SIRT2表達(dá) Control組、IL-1β組細(xì)胞按照上述方法培養(yǎng)以后，在細(xì)胞中添加含有1 mmol/L的PMSF的細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞裂解以后，轉(zhuǎn)移到EP管中，12 000 r/min離心10 min，吸取上清溶液，保存在-20℃。用BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)。取蛋白樣品，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，在上層膠中電壓為80 V，在下層膠中電壓為120 V，每個(gè)上樣孔添加30 μg蛋白樣品。取出蛋白凝膠，以150 V的電壓轉(zhuǎn)膜1 h以后，蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上。用5%的牛血清白蛋白將非特異性的位點(diǎn)封閉以后，再把NC膜放在1/500的一抗中，4℃過(guò)夜，NC膜再與1/3 000的二抗室溫中孵育2 h以后，按照ECL顯色試劑盒顯色后，用Band Scan分析條帶的灰度值，計(jì)算SIRT2灰度值/β-actin的灰度值。

1.6MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，接種到96孔板內(nèi)，細(xì)胞接種的密度為5×104個(gè)/ml，按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理后，分別在24、48、72、96 h時(shí)取出培養(yǎng)板，在每個(gè)孔內(nèi)加入MTT溶液約10 μl，置于37℃孵育4 h以后，把上清溶液吸棄，再加入150 μl的DMSO溶液，置于低速搖床上孵育10 min，置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm的OD值。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理24 h以后，以胰蛋白酶消化，2 000 r/min離心10 min，把上清吸棄以后，添加上樣緩沖液混合后，此時(shí)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，轉(zhuǎn)移到流式管中，添加5 μl的PI及Annexin V-FITC，置于室溫中孵育25 min后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8Western印跡檢測(cè)胞質(zhì)和線粒體中CytochromeC蛋白水平 取感染慢病毒后的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，按照Control組、IL-1β組、NC+IL-1β組、SIRT2+IL-1β組分組處理24 h以后，按照試劑盒提取細(xì)胞線粒體和胞質(zhì)中的蛋白，以Western印跡方法檢測(cè)CytochromeC蛋白水平，具體步驟同上，胞質(zhì)蛋白以β-actin為參照，線粒體蛋白以Porin為內(nèi)參。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1IL-1β誘導(dǎo)后SIRT2表達(dá)水平降低 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞中的SIRT2 mRNA和蛋白水平下降，提示IL-1β減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)，見(jiàn)圖1，表1。

圖1 IL-1β減少關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2蛋白表達(dá)

2.2慢病毒感染促進(jìn)IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá) 經(jīng)過(guò)IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞中的SIRT2水平升高，提示成功構(gòu)建了上調(diào) SIRT2的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，見(jiàn)圖2，表2。

2.3SIRT2提高IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖活性 IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的OD值明顯降低，而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞的OD值有所升高。過(guò)表達(dá)SIRT2拮抗IL-1β對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用，見(jiàn)表3。

表1 IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2水平

圖2 慢病毒感染上調(diào)IL-1β作用后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中SIRT2的表達(dá)

表2 各組SIRT2 mRNA及蛋白水平比較

與IL-1β組比較：1)P<0.05

2.4SIRT2抑制IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡率〔(26.14±2.87)%〕明顯高于Control組〔(6.25±0.47)%〕，而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞凋亡率〔(15.28±1.65)%〕較NC+IL-1β組〔(27.42±2.49)%〕明顯降低，過(guò)表達(dá)SIRT2減少IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

2.5SIRT2減少IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體中CytochromeC蛋白水平明顯降低，而胞質(zhì)中CytochromeC蛋白水平明顯升高。過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)處理以后，細(xì)胞線粒體中CytochromeC水平有所升高，胞質(zhì)中CytochromeC水平有所降低。過(guò)表達(dá)SIRT2抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放CytochromeC，見(jiàn)圖3，表4。

1～4：Control組，IL-1β組，NC+IL-1β組，SIRT2+IL-1β組圖3 SIRT2過(guò)表達(dá)減少IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體中CytochromeC蛋白水平

表3 SIRT2提高IL-1β條件下關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖活性

與Control組比較：1)P<0.05；與IL-1β比較：2)P<0.05，下表同

表4 SIRT2過(guò)表達(dá)對(duì)IL-1β處理后關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞質(zhì)和線粒體中CytochromeC蛋白水平的影響

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以軟骨組織破壞、軟骨變性、關(guān)節(jié)間隙變窄為主要特性，而作為軟骨組織的唯一組成細(xì)胞，軟骨細(xì)胞功能紊亂是關(guān)節(jié)炎發(fā)生的關(guān)鍵〔8〕。研究表明，骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生常常伴隨有軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)度等現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞受到炎癥因子等的刺激后，細(xì)胞凋亡水平升高，細(xì)胞損傷加重〔9，10〕。IL-1β作為一種炎癥因子，在骨關(guān)節(jié)炎患者中的表達(dá)水平升高，其可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞凋亡增多，提示成功構(gòu)建了IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型。

沉默信息調(diào)節(jié)因子基因家族(Sir2)是一類組蛋白去乙酰酶，其與哺乳動(dòng)物Sir2同源的蛋白共同組成Sirtuin蛋白家族，Sirtuin蛋白家族含有7個(gè)蛋白成員，在不同的組織和器官中表達(dá)水平不同〔12～15〕。SIRT1參與軟骨細(xì)胞炎癥，可以提高軟骨細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激能力并減少軟骨細(xì)胞炎癥等，SIRT1在骨關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮保護(hù)作用，目前研究表明，SIRT2和SIRT1一樣，作為Sirtuin蛋白家族的成員，都含有較高的去乙?；傅幕钚?，均在骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中表達(dá)下調(diào)，SIRT2可能也參與關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷發(fā)生〔16～19〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1β誘導(dǎo)后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的SIRT2表達(dá)水平降低，這與上述研究報(bào)道結(jié)果一致，均表明SIRT2可能參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。

有研究報(bào)道表明，IL-1β可以通過(guò)激活線粒體途徑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡，IL-1β能夠促進(jìn)線粒體中CytochromeC的釋放〔20，21〕。線粒體凋亡途徑又稱為內(nèi)源性凋亡途徑，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要分支，在幾乎所有的哺乳動(dòng)物凋亡中存在，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生與CytochromeC有關(guān)，CytochromeC是一個(gè)重要的凋亡激活因子，正常情況下，CytochromeC多存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到病理因素的刺激以后，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔打開，線粒體內(nèi)的CytochromeC釋放至細(xì)胞質(zhì)中，激活位于細(xì)胞質(zhì)中的凋亡反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生〔22，23〕。SIRT2具有抗細(xì)胞凋亡的作用，沉默其表達(dá)后可以減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在急性髓系白血病細(xì)胞、帕金森病細(xì)胞模型等中已經(jīng)得到證實(shí)〔24，25〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞線粒體釋放的CytochromeC增多，而過(guò)表達(dá)SIRT2后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)IL-1β誘導(dǎo)后，細(xì)胞凋亡率有所降低，線粒體釋放的CytochromeC減少，細(xì)胞增殖活性升高，說(shuō)明SIRT2可以通過(guò)線粒體途徑減少IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡損傷，SIRT2在軟骨細(xì)胞凋亡中發(fā)揮保護(hù)作用。

總而言之，SIRT2能夠通過(guò)減少線粒體釋放CytochromeC抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，提高軟骨細(xì)胞活性，SIRT2可能具有抗骨關(guān)節(jié)炎的作用，對(duì)于其作用機(jī)制還需要在以后進(jìn)行驗(yàn)證和探索。