李建民 葉 軍 王如珠 林 杰 劉 玲 王 斌

(泰州市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 泰州 225300)

臨床上目前最有效的心肌損傷標(biāo)記物主要是肌酸激酶同工酶(CK-MB) 及心肌肌鈣蛋白(cTn)I，而其最主要的缺點(diǎn)是組織釋放遲緩及特異性稍差。在探索急性心肌梗死(AMI)新的高效、敏感度及特異度更好的生物標(biāo)記物中，MicroRNA(MiR)受到關(guān)注〔1～3〕。有研究顯示MiR208特異表達(dá)于心肌細(xì)胞，參與心肌細(xì)胞的肥大、纖維化過(guò)程〔4，5〕。在正常人群中，循環(huán)系統(tǒng)幾乎檢測(cè)不到MiR-208b，但在心肌梗死動(dòng)物模型及心肌梗死患者中顯著增加〔4，6〕。在鑒別心肌梗死和其他疾病導(dǎo)致標(biāo)志物升高方面MiR-208b較cTnI有明顯的優(yōu)勢(shì)〔7～9〕。本研究主要評(píng)估MiR-208b在AMI的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1研究分組 采用前瞻性研究方法，選擇2017年1～12月泰州市人民醫(yī)院就診AMI患者60例為實(shí)驗(yàn)組、選取同期冠脈造影證實(shí)冠脈未見(jiàn)異?；颊?0例為對(duì)照組、選擇存在心絞痛癥狀且冠脈造影證實(shí)為冠心病不穩(wěn)定型心絞痛(UA)患者40例作為UA組。

1.2篩選標(biāo)準(zhǔn) 入選標(biāo)準(zhǔn)：①胸痛癥狀小于3 h。②均經(jīng)急診冠脈造影證實(shí)為AMI。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者主訴發(fā)病時(shí)間>3 h ；或者主訴發(fā)病時(shí)間雖然<3 h，但結(jié)合心電圖動(dòng)態(tài)演變，提示非急性期改變，cTnI 或CK-MB無(wú)動(dòng)態(tài)升高或首次檢測(cè)已接近峰值。②終末期腎病(ESRD)及腫瘤患者。

1.3研究?jī)?nèi)容 所有入選患者完善一般基礎(chǔ)資料，次日清晨空腹采血，空腹時(shí)乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集全血，離心分離血漿，送檢驗(yàn)科全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血肌酐。AMI組發(fā)病3 h，UA組及對(duì)照組于冠脈造影術(shù)后第2天清晨取靜脈血5 ml，EDTA二鉀(EDTA-K2)抗凝，離心取血漿，送檢驗(yàn)科測(cè)定cTnI、CK-MB水平(電化學(xué)發(fā)光法)。

1.4MiR-208b的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 用EDTA 抗凝采集各組血漿標(biāo)本，以U6snRNA為內(nèi)參。U6snRNA正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-′3；MiR-208b正向引物：5′-GCGCGATAAGACGAACAAAA-3′，反向引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。引物合成公司：南京金斯瑞科技有限公司。

1.4.1RNA提取 全血離心，取200 μl血清，加入1 ml預(yù)冷的Trizol，加入氯仿120 μl；12 000 r/min，4℃離心15 min；取無(wú)色上清水相移至另一離心管，水相體積約為所用Trizol試劑的60%；向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，靜置10 min；12 000 r/min，4℃離心10 min；去除上清，加入1 ml 70%的乙醇；12 000 r/min，4℃離心10 min；吸盡上清，加入15.0 μl的DEPC H2O溶解RNA沉淀，待完全溶解后于-80℃保存。

1.4.2RNA濃度和純度測(cè)定 按照cDNA第一鏈合成試劑盒(美國(guó) Thermo Fisher K1622)配制逆轉(zhuǎn)錄體系(兩步法)，到總體積為20 μl，混勻后在普通PCR儀上進(jìn)行42℃1 h、70℃10 min、4℃ 5 min的反應(yīng)。上述產(chǎn)物可立即進(jìn)行下一步的PCR反應(yīng)或-20℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定擴(kuò)增的片段大小與目的基因相一致。MiR-208b相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔct。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)；用受試者工作特征(ROC)曲線分析血漿MiR-208b含量對(duì)AMI的診斷效能，計(jì)算ROC曲線下面積(AUC)，AUC<0.5為無(wú)診斷價(jià)值。

2 結(jié) 果

2.1各組臨床特征比較 與對(duì)照組比較，AMI組在性別、吸煙、TC、血肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； AMI組年齡、高血壓患病數(shù)、糖尿病患病數(shù)、LDL-C均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與UA組比較，AMI組年齡、高血壓患病數(shù)、糖尿病患病數(shù)均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組臨床特征比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05；與UA組比較：2)P<0.05，下表同

2.2各組cTnI、CK-MB、MiR-208b水平比較 與對(duì)照組比較，AMI組、UA組在cTnI、CK-MB、MiR-208b表達(dá)上均明顯升高(P<0.05)；且AMI組各指標(biāo)升高較UA組顯著(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲線比較 MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.952、0.843、0.769，AUC<0.5為無(wú)診斷價(jià)值。 95%可信區(qū)間(95%CI)分別為0.90～0.99、0.73～0.93、0.67～0.86，見(jiàn)圖1。

表2 各組cTnI、CK-MB、MiR-208b水平比較

圖1 MiR-208b、cTnI、CK-MB的ROC曲線

3 討 論

AMI在臨床中常見(jiàn)，全國(guó)胸痛中心建設(shè)廣泛開(kāi)展〔10〕，AMI診治率明顯提升，但是目前對(duì)AMI標(biāo)志物的研究仍然沒(méi)有大的提升，特別是在心肌梗死早期發(fā)病4 h以?xún)?nèi)，沒(méi)有有效的AMI標(biāo)志物，對(duì)心肌梗死的早期診斷、早期治療提出了更高的要求。

在探索新的高效、敏感度及特異度更好、更早期的生物標(biāo)記物的研究中，miRNA取得了顯著的優(yōu)越性。miRNA是一種內(nèi)源性的小非編碼RNA 分子，與信使RNA 通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，調(diào)節(jié)其基因表達(dá)。miRNA在血清或血漿中穩(wěn)定表達(dá)，可抵抗反復(fù)凍融和被RNA酶降解。miRNA作為細(xì)胞內(nèi)的RNA，調(diào)控轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平，并認(rèn)為具有成為治療學(xué)靶點(diǎn)的可能〔2，5〕。

心肌miRNA在心肌中大量表達(dá)。它們?cè)谛呐K發(fā)生、心臟功能和病理方面起著核心作用。miR-133a主要控制早期的心臟新生階段，支持從胚胎干細(xì)胞和中胚層前體的心臟特定的肌肉譜系，miR-208和miR-499參與了晚期心原階段的調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)心臟細(xì)胞的分化到心肌細(xì)胞和快速/慢肌纖維規(guī)范。在心臟中，miR-1/133a通過(guò)調(diào)節(jié)心臟動(dòng)作電位的所有階段來(lái)控制心臟電導(dǎo)和自動(dòng)性。miR-208/499位于重鏈的肌凝蛋白基因內(nèi)，調(diào)節(jié)肌凝蛋白收縮蛋白的表達(dá)。在包括AMI在內(nèi)的心臟病理學(xué)中，心臟miRNA的表達(dá)發(fā)生了明顯的改變，導(dǎo)致了與心臟損傷、心律失常、細(xì)胞凋亡、纖維化、肥大和組織重建相關(guān)的有害影響。miR-146a、miR-499和miR-196a2的多態(tài)性對(duì)心血管疾病的發(fā)生，發(fā)展有明顯的影響。每種類(lèi)型的miRNA在心臟發(fā)育或心血管疾病的起源中都有各自的作用〔11〕。多項(xiàng)研究及薈萃分析〔12～14〕顯示，血漿miR-33及miR-10a表達(dá)與miR155與冠心病的發(fā)生、發(fā)展有明顯的聯(lián)系。在AMI、心臟miRNA的循環(huán)水平明顯升高使他們成為一個(gè)有前途的診斷AMI的早期診斷標(biāo)志〔7〕。

cTnI主要結(jié)合在肌原纖維上，僅不到5%儲(chǔ)存在胞質(zhì)中；miRNA 蛋白復(fù)合物主要存在于胞質(zhì)。所以在心肌細(xì)胞受到損害并壞死時(shí)，兩者的釋放時(shí)間曲線不同，miRNA 可更早地在循環(huán)血中檢測(cè)到〔15〕。在大鼠AMI模型中發(fā)現(xiàn)MiR-208b有顯著升高，而心肌壞死區(qū)和邊緣區(qū)的組織病理卻未能檢測(cè)到。循環(huán)血中的miRNA 似乎并不是來(lái)自于細(xì)胞壞死或細(xì)胞凋亡，而是屬于某種病生代償機(jī)制〔16〕。研究顯示〔8，9，14〕，在歐美人群及亞洲人群中，miRNA-208b在健康人群中幾乎沒(méi)有表達(dá)，在心肌梗死人群中顯著表達(dá)，故認(rèn)為miRNA-208b在AMI人群中有較高的敏感性及特異性。本研究顯示在AMI人群中，其表達(dá)明顯高于UA組及對(duì)照組，ROC曲線顯示，其診斷效能要優(yōu)于cTnI及CK-MB。MiR-208b的釋放是否存在其他機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。