張靜玲，王克利，閆雙寶

(1.北京科技大學(xué)醫(yī)院 內(nèi)科，北京100088;2.火箭軍總醫(yī)院 骨科，北京100088)

槲皮素(Quercetin)是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于許多膳食植物(水果、蔬菜、谷物等)中，以蕎麥、西紅柿、山楂、洋蔥中含量較高。許多中草藥如羅布麻、槐米、側(cè)柏葉、高良姜、款冬花、桑寄生、三七、銀杏等均含有槲皮素。體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，槲皮素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞株如肝癌、口腔癌、白血病、肺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞系凋亡[1]。骨肉瘤(OS)是兒童和青少年中最常見的第三種癌癥，也是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤。盡管隨著新的化療方案、手術(shù)技術(shù)和放射學(xué)分期的發(fā)展，患者5年生存率和治愈率顯著增加，但腫瘤耐藥性問題仍較為突出[2]。細(xì)胞凋亡是一種固有的細(xì)胞反應(yīng)，對哺乳動物的發(fā)育及維持組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，同時，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是抗癌化療的主要目標(biāo)之一。本研究旨在探討槲皮素對人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63凋亡的影響，并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1主要試劑

MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)及TRIzol為Gibco產(chǎn)品；MTT、DMSO及胰酶購自北京鼎國科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒為深圳碧云天公司產(chǎn)品；二步法RT-qPCR法檢測試劑盒、哺乳動物總蛋白提取試劑盒、Bradford蛋白定量試劑盒均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；抗人GAPDH、Bcl-2、bax及細(xì)胞色素C(cytochrome C)產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品;辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自中杉金橋公司;其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。MG-63細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。將處于對數(shù)生長期的MG-63細(xì)胞以2×105個細(xì)胞/孔接種于6孔培養(yǎng)板，用含40 μmol/L槲皮素培養(yǎng)48 h，以不含槲皮素培養(yǎng)基作為對照。

1.3RNA提取及RT-PCR分析

按TRIzol說明書提取MG-63細(xì)胞總RNA，并根據(jù)二步法RT-qPCR法檢測試劑盒用Oligo(dT)作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，以特異性Bcl-2和bax 引物進(jìn)行PCR，以GAPDH做為內(nèi)參，按2-ΔΔCT計(jì)算Bcl-2和bax的相對表達(dá)量。ΔΔCT=[Ct(槲皮素組caspase 3)-Ct(槲皮素組GAPDH)]-[Ct(對照組caspase 3)-Ct(對照組GAPDH)]。GAPDH引物序列為：5’-GTTACCAGGGCTGCCTTCTC-3’，5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’;Bcl-2引物序列為：5’-TGGCCTTCTTTGAGTTCGGT-3’，5’-GTTCCACAAAGGCATCCCAGC-3’;bax引物序列為：5’-ACACCTGAGCTGACCTTGGA-3’， 5’-AGTTCATCGCCAATTCGCCT-3’。

1.4蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)分析

各組MG-63細(xì)胞用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的哺乳動物細(xì)胞裂解液充分裂解，并用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。50 μg樣品用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用抗Bcl-2、bax、細(xì)胞色素C及GAPDH為分別于4℃孵育過夜。用TBST洗滌PVDF膜后，室溫下以相應(yīng)HRP結(jié)合一抗1 h，洗膜后用ECL法顯色，并曝光顯影。用圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)對照。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果

2.1槲皮素對MG-63細(xì)胞Bcl-2、baxmRNA表達(dá)比較

本研究采用RT-qPCR法檢測了槲皮素處理后細(xì)胞中Bcl-2和bax mRNA表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組比較，槲皮素處理組MG-63細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低，而bax mRNA表達(dá)明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 槲皮素對MG-63細(xì)胞bcl-2、bax mRNA表達(dá)比較

與對照組比較，*P<0.05

2.2槲皮素對MG-63細(xì)胞Bcl-2、bax及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比較

本研究采用Western blot法檢測了槲皮素處理后細(xì)胞中Bcl-2、bax及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，槲皮素處理組MG-63細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);同時，槲皮素處理組bax、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著高于對照組細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 槲皮素對MG-63細(xì)胞bcl-2、bax及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比較表2 槲皮素對MG-63細(xì)胞Bcl-2、bax及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)比較

分組Bcl-2/GAPDHbax/GAPDH細(xì)胞色素C/GAPDH對照組槲皮素組0.83±0.090.64±0.06*0.09±0.030.21±0.03*0.12±0.010.24±0.02*

與對照組比較，*P<0.05

3 討論

槲皮素是各種茶、蔬菜和水果中主要的膳食類黃酮之一。研究表明，槲皮素具有廣泛的抗癌作用，可選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3]。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族可以分為兩大類，一類是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W、Mcl-1和CED9等，另一類是促細(xì)胞死亡的，主要包括bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik和Bid等。Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等是細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)因子，在許多類型的細(xì)胞受到外界刺激時能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。細(xì)胞色素C釋放是線粒體途徑細(xì)胞凋亡的標(biāo)志事件。Bcl-2家族蛋白在調(diào)控線粒體功能和細(xì)胞色素C釋放中起重要作用，但它們調(diào)控細(xì)胞色素C釋放的分子機(jī)制目前還不完全明了。研究表明，bax是最早發(fā)現(xiàn)的促凋亡家族成員，在正常細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞漿，受到凋亡刺激后轉(zhuǎn)位到線粒體上，直接或間接地在線粒體上形成孔道，引起細(xì)胞色素C的釋放。Bcl-2主要是通過抑制bax的促凋亡功能來抑制細(xì)胞凋亡，70%的乳腺癌、30%-60%的前列腺癌、90%的結(jié)腸癌中都發(fā)現(xiàn)了Bcl-2表達(dá)水平顯著增高，表明Bcl-2的高表達(dá)與腫瘤發(fā)生有關(guān)。本研究結(jié)果表明，槲皮素可上調(diào)促凋亡蛋白MG-63細(xì)胞bax和細(xì)胞色素C的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，提示槲皮素至少通過線粒體依賴凋亡途徑降低MG-63細(xì)胞的活力，當(dāng)然，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。