李貞景，薛意斌，劉 妍，徐 晗，任志遠，王昌祿*

桔霉素又叫桔青霉素，是一種真菌毒素，最早由Hetherington和Raaisttrick于1931年從桔青霉（Penicillium citrinum）培養(yǎng)物的過濾液中分離得到[1]。桔霉素呈檸檬黃色針狀菱形結晶，分子式為C13H14O5，存在離子態(tài)和非離子態(tài)兩種構型（圖1）。桔霉素能與金屬離子形成螯合物，但其性質不穩(wěn)定，在酸性、堿性溶液及加熱條件下都易發(fā)生分解[2]。

圖1 桔霉素的結構式（A）及其兩種構型（B）Fig. 1 Structural formula (A) and two configurations of citrinin (B)

桔霉素是紅曲菌（Monascus spp.）的次級代謝產物。紅曲菌在我國的使用歷史悠久，但長期以來僅用于食品著色和釀酒，產業(yè)規(guī)模較小。在我國一般將由紅曲菌發(fā)酵制成的相關產品總稱為紅曲。從20世紀90年代開始，隨著國內市場對天然、健康食品需求的不斷增加以及歐美等國對我國紅曲產品的日益認可，我國的紅曲產業(yè)進入了快速發(fā)展時期。但在1998年，歐洲學者從紅曲中發(fā)現(xiàn)了對人體有潛在危害的桔霉素，歐美各國也相繼制定了紅曲產品中桔霉素的限量標準。在現(xiàn)有技術條件下，我國紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產品紅曲紅、紅曲黃等紅曲色素中的桔霉素問題基本得到了解決，但固態(tài)發(fā)酵紅曲米中的桔霉素含量仍遠高于歐美國家的限量標準，這既影響了我國紅曲產品的出口，也對我國居民身體健康造成潛在危害。因此，有效控制紅曲菌中桔霉素的含量是紅曲產業(yè)發(fā)展中必須解決的問題之一。

1 桔霉素的毒性

紅曲菌中的桔霉素之所以日益引起人們的關注，主要在于其具有較強的毒性。研究表明，桔霉素有腎臟毒性，50 μmol/L的桔霉素就能使PK15細胞的鈣穩(wěn)態(tài)失去平衡，導致細胞死亡[3]。桔霉素與赭曲霉毒素A聯(lián)合使用可造成肝細胞活性氧水平升高、DNA鏈斷裂和線粒體介導的細胞凋亡，且毒性具有協(xié)同增強作用[4]。桔霉素與展青霉素等其他真菌毒素共同使用，其毒性也表現(xiàn)出協(xié)同增強效果[5]。食品一旦受到桔霉素的污染，有其他真菌毒素共存的可能性極大；因此桔霉素毒性的這種協(xié)同作用應當引起研究人員的足夠重視。桔霉素具有致畸性，Ciegler等[6]發(fā)現(xiàn)，給發(fā)育的雞胚胎注射150 μg/egg的桔霉素后，胚胎的致畸率高達73%。Wu Yu等[7]也發(fā)現(xiàn)，桔霉素能夠降低小鼠卵母細胞成熟和早期胚胎發(fā)育的能力，這可能是由于氧化應激誘導細胞凋亡引起的。

針對桔霉素的毒性機制雖然已有一些研究成果，如Chagas等[8]的研究表明，桔霉素能在肝細胞線粒體聚集并干擾電子傳遞系統(tǒng)，抑制細胞中蛋白質的合成，引起肝糖原含量下降，導致甘油三脂和膽固醇合成受阻；但整體來看仍缺乏有力的證據(jù)，因此，有關桔霉素毒性機制的研究仍需進一步加強[9]。

2 桔霉素限量標準與檢測方法

因為桔霉素對人體有極大的危害性，許多國家和地區(qū)都已將桔霉素列為食品危險成分并制定了嚴格的限量標準（表1）。目前，我國僅對紅曲紅和紅曲黃色素中的桔霉素做了限量規(guī)定（紅曲紅色素的限量標準為0.04 mg/kg，紅曲黃色素的限量標準為1.0 mg/kg）[10-11]，但對固態(tài)發(fā)酵的紅曲米等紅曲產品尚未作出限量規(guī)定。隨著人們對食品尤其是紅曲菌中桔霉素問題的日益重視，制定更加嚴格、規(guī)范的桔霉素限量標準已經(jīng)成為趨勢，今后技術水平落后、產品桔霉素含量高的紅曲企業(yè)可能面臨嚴峻的生存問題[12]。

目前，桔霉素的主要檢測方法有抑菌圈法、免疫學分析法、薄層層析法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[13-15]等。抑菌圈法精密度較差。薄層層析法相對簡單易行，但靈敏度和精密度較低，近年來已很少被使用。潘振球[13]、Richard[16]等都采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用法對桔霉素進行檢測，但成本較高。免疫學分析法主要是酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA），一般又分為直接競爭法和間接競爭法兩種。間接法桔霉素ELISA檢出限為0.4～0.8 μg/L，直接法為2～4 μg/L[17]，但該法需專用的抗體，檢測費用較高，難以廣泛應用。高效液相色譜法是目前檢測桔霉素含量最便捷、可靠的一種方法，它具有分離效率高、選擇性好、靈敏度高、應用范圍廣等優(yōu)點，被普遍應用于紅曲產品中桔霉素含量的檢測。我國在2016年制定的GB/T 5009.222—2016《食品安全國家標準 食品中桔青霉素的測定》[18]中規(guī)定，大米、玉米、辣椒、紅曲類產品中桔霉素的測定應采用免疫親和柱凈化-高效液相色譜法，而大米、大麥、燕麥、小麥類產品可采用C18固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法。該標準是在GB/T 5009.222—2008《紅曲類產品中桔青霉素的測定》[19]的基礎上修訂的，增加了樣品的凈化步驟，擴大了檢測方法的適用范圍，已于2017年6月23日正式實施。

表1 國外桔霉素相關限量標準Table 1 Citrinin limits in other countries

3 紅曲菌中桔霉素的合成途徑及調控基因

對于紅曲菌中次級代謝產物的生物合成，目前得到廣泛認可的是聚酮合酶途徑，色素、桔霉素、莫納可林K等皆為聚酮類化合物，由紅曲菌聚酮體代謝產生[22]。1999年以來，大量學者對這一代謝途徑進行了研究。綜合目前研究成果，紅曲菌中桔霉素的生物合成途徑如圖2所示。

圖2 紅曲菌中桔霉素的生物合成途徑[23-26]Fig. 2 Biosynthetic pathway of citrinin by Monascus spp.[23-26]

從圖2可以看出，在聚酮合酶的催化下，一分子乙酰輔酶A與3 個丙二單酰輔酶A通過反復縮合和延伸形成桔霉素和色素的共同前體四酮體，此過程由pksCT編碼的聚酮合酶（polyketide synthase，PKS）催化。然后分為兩條途徑：一條為四酮體與丙二單酰輔酶A縮合生成己酮生色團，并經(jīng)過一系列反應生成紅曲色素；另一條為四酮體與乙酰輔酶A經(jīng)甲基化縮合、氧化、脫氫、脫水等步驟生成桔霉素，此過程可能是由氧化還原酶（ctnB）、短鏈脫氫酶（ctn-orf1）、加氧酶（ctn-orf3）等基因調控完成[24-25]。

隨著研究的不斷深入，調控桔霉素生物合成的相關基因不斷被發(fā)現(xiàn)。除上述pksCT、ctnB、orf1、orf3外，還發(fā)現(xiàn)12 種桔霉素基因參與桔霉素代謝，分別為脂肪酰輔酶A合成酶（ctnI）、短鏈脫氫酶（ctnE、ctnH）、氧化還原酶（ctnD）、轉錄激活因子（ctnA）、變位酶（ctnF）、碳酸纖酶（ctnG）、膜轉運蛋白（orf5）、WD重復蛋白（ctnR）基因和假設基因（orf6、orf7、orf8）（圖3）。

圖3 紅曲菌中與桔霉素生物合成有關的基因[26]Fig. 3 Citrinin synthesis gene cluster from Monascus spp.[26]

4 控制紅曲菌中桔霉素含量的策略

4.1 控制桔霉素的傳統(tǒng)方法

菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、改變外界環(huán)境因子以及發(fā)酵結束后去毒處理都是控制紅曲菌中桔霉素含量的傳統(tǒng)方法。這些方法一般和生產過程密切相關，簡單易行、效果突出且成本較低，是目前控制紅曲菌中桔霉素含量的主要策略。

4.1.1 低產或不產桔霉素菌株的選育

國內外學者在紅曲菌菌種選育與改造方面進行了大量研究。方春玉等[27]通過紫外線照射及超聲復合誘變獲得紅曲菌突變株，經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后其酯化能力提高了83.2%，且桔霉素含量極低。郎天丹等[28]利用混合粒子場輻照處理紫色紅曲菌，獲得高產莫納可林K、低產桔霉素的M1-20和M2-4兩株突變株，且表現(xiàn)出良好的遺傳穩(wěn)定性。陳勉華等[29]篩選得到了一株高產莫納可林K和γ-氨基丁酸、低產桔霉素和色素的紅曲菌C002。陳福生等[30]發(fā)現(xiàn)了一種不產桔霉素的叢毛紅曲菌（Monascus pilosus）。選育低產或不產桔霉素的菌株雖然能從源頭上降低紅曲菌中的桔霉素含量，但由于桔霉素的合成與色素和莫納可林K的合成都屬于聚酮合酶途徑，在桔霉素產量降低的同時往往也造成色素和莫納可林K產量的下降。

4.1.2 優(yōu)化培養(yǎng)基

虞慧玲等[31]研究了多種碳源、氮源對紅曲色素及桔霉素產量的影響，結果表明玉米粉為最佳的碳源，大豆為最佳氮源，此時桔霉素含量較低，且色價色調良好。甘氨酸、酪氨酸、精氨酸、絲氨酸和組氨酸作為單一氮源均可促進紅曲色素的產生，同時對桔霉素的合成起到抑制作用，且組氨酸的效果最好。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在真菌中組氨酸可以通過組氨酸脫羧酶產生組胺，而組胺的分解代謝由二胺氧化酶催化，釋放NH3和H2O2；因此，組氨酸作為唯一氮源時桔霉素減少可能是由于桔霉素被在組氨酸同化過程中產生的H2O2所降解[32]。岳建明等[33]發(fā)現(xiàn)，添加適量NH4NO3、（NH4）2SO4、NH4Cl有利于提高紅曲黃色素的生物合成，同時抑制桔霉素的生成，可能是因為這3 種銨鹽所提供的低pH值環(huán)境有利于對桔霉素產量的控制。趙靖等[34]的研究發(fā)現(xiàn)，己酸、辛酸等5 種脂肪酸均能明顯抑制桔霉素的合成，且脂肪酸對桔霉素的影響不是通過調節(jié)pH值實現(xiàn)的。梁斐等[35]在紅曲菌Winter4固態(tài)發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)，添加環(huán)磷酸腺苷、生物素均可抑制桔霉素的合成。

4.1.3 改變環(huán)境因子

溶氧量、溫度、光照、發(fā)酵時間等外界環(huán)境因子均能夠對紅曲菌中桔霉素的產量產生影響，通過對這些發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和控制可達到降低桔霉素含量的目的。邢淑婕等[36]通過改變裝液量，發(fā)現(xiàn)溶氧對紅曲菌發(fā)酵產桔霉素與色素的影響較大，在滿足溶氧需求的情況下，應盡可能采用低通風量以降低桔霉素的生成。馬博雅等[37]發(fā)現(xiàn)，缺氧培養(yǎng)可以顯著降低紅曲菌中桔霉素的產量，且缺氧條件可能是通過抑制ctnA基因表達和促進orf7基因表達來抑制桔霉素的合成，而pksCT基因不是調控桔霉素合成的關鍵基因。虞慧玲等[31]提出，適度提高液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度（36 ℃）有利于高產色素和低產桔霉素。還有研究表明，堿性條件可以促使細胞內的紅曲色素排向胞外并顯著抑制桔霉素的產生[38]。此外，由于桔霉素主要產生于發(fā)酵后期，而色素的合成早于桔霉素，因此，合理的控制發(fā)酵時間有利于得到色素的同時減少桔霉素的產量。光線的波長對紅曲菌次級代謝產物的合成亦有影響，研究發(fā)現(xiàn)，紅光能促進紅曲色素的合成并抑制桔霉素的合成，而藍光則促進γ-氨基丁酸的合成[39]。

4.1.4 發(fā)酵結束后去毒

在發(fā)酵產物中已經(jīng)存在桔霉素或者桔霉素含量偏高的時候，可以通過一些物理化學手段進行去毒。李蕙蕙等[40]的實驗表明，隨著輻照強度的增大，紅曲米與紅曲米提取液中的桔霉素、莫納可林K及其類似物含量均逐步減少，在紅曲米的提取液中，當輻照劑量超過5 kGy時桔霉素全部降解，當輻照劑量超過10 kGy時提取液中的莫納可林K及其類似物完全降解。張曉偉等[41]發(fā)現(xiàn)，桔霉素能夠吸收可見光，主要是短波長可見光及紫外光的能量，從而對桔霉素結構造成破壞，且藍光、紫外光還可以使桔霉素溶液中產生一些氧化自由基，而這些氧化自由基可以與桔霉素發(fā)生反應，破壞桔霉素的分子結構，從而達到降解桔霉素目的。Shi等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)體積分數(shù)45%乙醇溶液、1.5%磷酸溶液提取70 min可去除91.6%的桔霉素，且能保留79.5%的莫納可林K。上述方法雖然能夠在一定程度上達到降低桔霉素含量的效果，但往往也會對紅曲菌中的色素及莫納可林K等成分造成一定的破壞，且有時會引進一些新的化學物質，因此，在實際生產應用中可行性不高。

4.2 生物方法控制桔霉素

應用生物方法控制微生物中的有害代謝產物，具有綠色環(huán)保、安全高效等優(yōu)勢，近年來被逐漸重視。生物方法控制紅曲菌中的桔霉素含量主要有3 種：1）控制產毒途徑，從源頭抑制桔霉素的合成，此種方法雖然行之有效，但由于基因改造菌株的安全性有待評估，因此并未得到廣泛應用；2）混菌發(fā)酵，利用微生物拮抗作用控制桔霉素產量，但由于混合發(fā)酵的限制條件較多，要選取生長條件與紅曲菌相近的真菌，因此還需要深入研究；3）微生物脫毒，對已經(jīng)存在的毒素進行脫毒，是其他方法無法替代的，并且具有可實踐性，是近年來研究的熱點。

4.2.1 控制產毒途徑

控制產毒途徑，即從分子水平上控制桔霉素的合成。首先利用基因組學和蛋白組學等方法確定桔霉素的合成途徑和相關基因，再對這些基因進行改造，或者研究能夠阻斷桔霉素合成的特定添加物進而控制桔霉素的代謝。雖然桔霉素合成受多種基因、基因簇的調節(jié)和控制，且目前尚未研究透徹，但多位學者在桔霉素合成途徑和相關基因已有成果的基礎上，對紅曲菌中桔霉素的合成基因進行了改造[43-49]。

Shimizu等[43]克隆了紫色紅曲菌pksCT基因的側翼區(qū)域，所得的桔霉素合成基因簇包括pksCT基因和5 個開放閱讀框（orf1、orf2、orf3、orf4和orf5），敲除ctnA基因后，桔霉素產量顯著下降，且該基因簇中的大部分基因在mRNA水平上的相對表達量也明顯減少。He Yi等[44]報道敲除orf1和orf2基因后，紅曲菌桔霉素產量顯著降低。關于ctnE、ctnG、ctnH和orf7基因在桔霉素代謝途徑中的作用亦有報道[45-48]。這些研究雖然在不同程度上降低了桔霉素的含量，但紅曲菌有益代謝產物產量也隨之減少。

阮瓊芳[49]通過Blast比對分析，進一步預測?；o酶A合成酶（Acyl-CoA synthetase，ACS）和芳香醇脫氫酶（glucose-methanol-choline oxidoreductase，GMC）基因可能與桔霉素的生物合成有關，據(jù)此構建了ASC缺失菌株ACS-6和GMC缺失菌株GMC-8，并推測ACS基因參與桔霉素和色素共同前體物質的合成，GMC基因參與桔霉素和色素的PKS后修飾過程。通過特定添加物干擾桔霉素合成途徑的研究也有報道。例如，添加不同濃度環(huán)磷酸腺苷可以激活一種蛋白激酶引起的桔霉素合成有關基因的變化，進而控制調節(jié)紅曲色素和桔霉素的合成[50]。這些研究為提高紅曲色素產量的同時降低桔霉素含量提供了新的研究思路，如果能明確桔霉素的生物合成途徑中桔霉素合成支路的調控基因和相關酶系，則可通過敲除關鍵基因或添加關鍵酶的抑制劑，抑制桔霉素的合成，使四酮體流向色素合成途徑。

4.2.2 混菌發(fā)酵

微生物混合發(fā)酵在生產實踐上已有應用，它可以達到許多情況下單菌發(fā)酵所不能達到的生產效果，這主要是由于多菌發(fā)酵是一個生物混合體系，體系中的微生物之間大多具有生長代謝的協(xié)調作用[51]。在桔霉素控制方面，郝常明等[52]提出，采用生長條件與紅曲菌相近，但能利用桔霉素或能生成抑制桔霉素中間產物形成的真菌一同培養(yǎng)，可降低桔霉素的含量。張建玲[53]的研究發(fā)現(xiàn)，與紅曲菌純培養(yǎng)相比，紅曲菌與酵母或乳酸菌混合培養(yǎng)不但有利于促進紅曲色素生成，還能抑制桔霉素的產生?；炀l(fā)酵雖然在很多領域都有成功實踐的案例，但混菌體系的相關機制研究還不夠深入，混菌體系的協(xié)調控制也具有較大的難度，缺乏有效的理論指導，仍需要深入研究。

4.2.3 微生物脫毒

微生物脫毒主要是通過自身代謝產物或相關酶對已經(jīng)產生的毒素進行降解脫毒。微生物脫毒在某些毒素的脫除上已經(jīng)有了很多報道[54-55]。在桔霉素的微生物脫毒研究中，Iwahashi等[56]發(fā)現(xiàn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可以通過谷胱甘肽的運輸對桔霉素進行脫毒。Azizi等[57]在小麥粉中加入釀酒酵母，48 h后樣品中桔霉素含量有所降低。整體上看，桔霉素微生物脫毒方面的研究相對較少，其具體機制、脫毒后產物的安全性以及參與脫毒過程的代謝產物或酶種類還不明確，仍需要進一步研究。

5 結 語

目前，雖然我國已經(jīng)制定了紅曲紅和紅曲黃色素的桔霉素限量標準，但隨著人們對紅曲產品安全性的日益關注以及新版桔霉素含量測定標準的實施[18]，制定更多、更嚴格的桔霉素限量標準將成為趨勢，而這將使我國的紅曲企業(yè)尤其是紅曲菌固態(tài)發(fā)酵企業(yè)面臨新的挑戰(zhàn)。因此，加強對紅曲菌尤其是固態(tài)發(fā)酵紅曲米中桔霉素含量有效控制方法的研究，生產低桔霉素含量甚至不含桔霉素的紅曲產品顯得尤為重要。

目前，研究人員主要從菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化、改變外界環(huán)境因子和控制產毒途徑等方面降低紅曲菌及其產品中的桔霉素含量，但在實際生產中許多方法操作復雜或成本較高，因而難以推廣。今后對紅曲菌中桔霉素的有效控制應該綜合運用基因組學、蛋白組學等分子生物學手段，一方面準確找到控制桔霉素合成或降解的相關基因及途徑，通過阻斷合成或促進降解來達到降低桔霉素產量的效果；另一方面應探究環(huán)境因子對紅曲菌中桔霉素的調控規(guī)律，通過特定的培養(yǎng)環(huán)境定向調節(jié)桔霉素的產量。另外，從政策層面來說，國家“十二五”規(guī)劃中已有支持紅曲菌中桔霉素的研究課題（如江南大學和廣東天益生物科技有限公司已完成的高色價、低桔霉素紅曲紅色素生產的產業(yè)化項目），“十三五”期間，國家在政策和資金上應進一步加大支持力度，繼續(xù)推動高校和企業(yè)加強低桔霉素含量紅曲產品的技術研發(fā)，突破紅曲產品出口的技術貿易壁壘，為我國紅曲產品走向國際市場提供支持。