黃蓉 夏朝霞 楊峂 任舟輝

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性的身心健康[1-2]。雖然乳腺癌的治療取得了很大進展，但其發(fā)生及轉(zhuǎn)移的分子機制仍不清楚，有待進一步研究。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，紡錘體和動粒相關(guān)蛋白2（spindle and kinetochore associated protein 2，SKA2）是參與細胞有絲分裂的相關(guān)基因，其能維持有絲分裂中期赤道板的穩(wěn)定和適時關(guān)閉紡錘體檢測點，從而保證細胞順利完成有絲分裂中期并進入后期[3]。研究發(fā)現(xiàn)SKA2基因及其蛋白表達與一些惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為和預(yù)后有著密切關(guān)系[4-12]。本研究擬采用實時熒光定量PCR法和免疫織化染色法分別檢測乳腺癌組織及癌旁組織中SKA2的表達情況，分析乳腺癌中SKA2表達水平與患者年齡、腫瘤大小、TNM分期、組織學(xué)分級、病理分型、分子分型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況等臨床病理特征的相關(guān)性，從而探討SKA2的表達與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為研究乳腺癌的發(fā)病和轉(zhuǎn)移機制，判斷預(yù)后提供參考。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本 收集2015—2017年在寧波市第二醫(yī)院乳腺外科行乳腺癌根治術(shù)后患者的石蠟包埋組織標(biāo)本160例及新鮮冷凍乳腺癌、癌旁組織標(biāo)本40對。160例患者均為女性，年齡 41～75（55.3±11.4）歲；腫瘤直徑＜2cm 78例，2～5cm 55例，＞5cm 27例；非浸潤性癌32例，浸潤性癌128例；TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ期40例，Ⅲ期64例，Ⅳ期8例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移106例，未轉(zhuǎn)移54例。40對新鮮乳腺癌、癌旁組織標(biāo)本保存于-80℃冰箱內(nèi)，癌旁組織分別取自標(biāo)本上切緣或下切緣。所有標(biāo)本均經(jīng)病理檢查證實，由病理科醫(yī)師閱片并記錄TNM分期、組織學(xué)分級、病理分型、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理資料。所有患者術(shù)前均未接受放、化療或內(nèi)分泌治療等任何抗腫瘤治療。

1.2 實時熒光定量PCR法檢測SKA2 mRNA表達水平 取出凍存的40對新鮮乳腺癌及癌旁組織標(biāo)本，加入100μl裂解液研磨成勻漿狀，置入1.5ml離心管中，以Trizol法抽提總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司，批號：00422714，規(guī)格：100rxns）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩０丛噭┖刑峁┑臈l件進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：95℃10min，1個循環(huán)；95℃ 10s，60℃ 1min，45 個循環(huán)?？偡磻?yīng)體積為10μl，包括 SYBR Green PCR Master Mix 5μl，正向引物0.25μl，反向引物 0.25μl，逆轉(zhuǎn)錄出的 DNA 模板 4.5μl。SKA2 正向引物：5′-CTGAAACTATGCTAAGTGGGGGAG-3′，反向引物：5′-TTCCAAACATCCTGACACTCAAAAG-3′；內(nèi)參 GAPDH 正向引物：5′-AAGCCTGCCGGTGACTAAC-3′，反向引物：5′-GCATCACCCGGAGGAGAAAT-3′；引物序列由深圳華大基因公司設(shè)計合成。采用2-ΔΔCt計算SKA2 mRNA表達水平。根據(jù)計算公式將標(biāo)準(zhǔn)值設(shè)為1，＞1為高表達，＜1為低表達。

1.3 免疫組化染色法檢測SKA2蛋白表達 160例女性乳腺癌石蠟標(biāo)本行SKA2蛋白表達檢測。實驗嚴(yán)格按照免疫組化染色S-P試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：SNM504，規(guī)格：160張片）進行，組織切片常規(guī)脫蠟至水，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，放入EDTA抗原修復(fù)液，PBS沖洗，兔血清封閉，滴加兔抗人SKA2多克隆抗體（美國 Thermo公司，批號：PA5-63689，1∶1 000），4℃冰箱過夜，PBS沖洗，滴加二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054，1∶2 000），PBS 沖洗，滴加DAB顯色劑，復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，封片，顯微鏡觀察，以PBS代替一抗作為陰性對照。SKA2陽性信號呈棕褐色顆粒，主要定位于細胞核。參照許良中等[13]的免疫組化反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，綜合考慮切片中陽性細胞占所觀察同類細胞數(shù)的百分比和陽性細胞著色強度兩項指標(biāo)，半定量判斷結(jié)果。按陽性細胞百分比記分：＜5%為0分，5%～＜25%為1分，25%～＜50%為2分，50%～＜75%為3分，≥75%為4分；按陽性細胞著色強度記分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。最后兩者乘積：其中＜6分為低表達；≥6分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；等級資料組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織及癌旁組織中SKA2 mRNA表達水平比較 乳腺癌組織中SKA2 mRNA表達水平為2.46±2.42，明顯高于癌旁組織的1.10±0.46，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。SKA2 mRNA在乳腺癌中的高表達率為 70.0%（28/40），見圖 2。

圖1 乳腺癌組織及癌旁組織中SKA2 mRNA表達水平比較

圖2 乳腺癌組織中SKA2 mRNA表達水平

2.2 乳腺癌組織中SKA2蛋白表達水平比較 乳腺癌組織中SKA2的陽性表達在鏡下主要出現(xiàn)在細胞核中，為棕褐色顆粒。Ⅲ期+Ⅳ期患者SKA2蛋白表達水平為21.75± 2.87，顯著高于Ⅰ+Ⅱ期患者的 10.00±1.63，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖 3。

圖3 不同TNM分期乳腺癌組織中SKA2蛋白表達水平比較

2.3 SKA2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系SKA2蛋白表達與患者TNM分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均有關(guān)（均P＜0.01），而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、病理分型、分子分型均無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 SKA2蛋白表達與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是一類生物特征各異的疾病，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是由多基因、多階段協(xié)同作用的結(jié)果[14]。傳統(tǒng)的乳腺癌治療方案普遍存在術(shù)后容易復(fù)發(fā)、晚期患者生存率低、化療或內(nèi)分泌耐藥等問題[15]。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子指標(biāo)的靶向治療成了目前的研究熱點之一。

SKA2是2006年首次發(fā)現(xiàn)的參與組成紡錘體與動粒相關(guān)復(fù)合物的重要蛋白質(zhì)。其通過與SKA1、SKA3結(jié)合，形成SKA復(fù)合體，進而使紡錘體的微管穩(wěn)定地附著在染色體的動粒上，確保有絲分裂中期染色體排列到赤道面上形成赤道；調(diào)節(jié)紡錘體組裝檢測點，從而保證染色體正確的分配到子細胞中[16-17]。近年研究發(fā)現(xiàn)，SKA2與腫瘤密切相關(guān)。繼Rice等[4]2008年首次發(fā)現(xiàn)SKA2在肺癌中顯著性高表達，并對肺癌細胞的增殖起著非常重要的作用后，其他國內(nèi)外學(xué)者也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)SKA2在肺癌[5-6]、腎癌[7]、胰腺癌[8]、胃癌[9]、膠質(zhì)瘤[10]、骨肉瘤[11-12]中扮演著癌基因的角色，并通過不同的調(diào)控機制，參與細胞的增殖與凋亡；且SKA2的表達與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。然而SKA2在乳腺癌中的研究甚少。

本實驗發(fā)現(xiàn)，新鮮乳腺癌組織中SKA2 mRNA表達水平顯著高于癌旁組織，SKA2在乳腺癌中的高表達率為70.0%；160例乳腺癌石蠟標(biāo)本中，SKA2蛋白表達與患者TNM分期和淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移均有關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、病理分型、分子分型均無關(guān)，與Shi等[18]報道相似，說明SKA2蛋白表達與乳腺癌的臨床分期和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本實驗證明SKA2基因表達是反映乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、生物學(xué)行為和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物之一。

目前，對SKA2的研究主要集中于人類多種惡性腫瘤中的表達及細胞學(xué)功能影響，其在腫瘤中的分子作用機制，特別是對其上下游調(diào)節(jié)分子的鑒定，依然有待進一步深入研究。因此，深入研究SKA2在惡性腫瘤中的作用機制，將為以SKA2為靶點的腫瘤靶向治療提供實驗依據(jù)。