張小芳，付大友

(四川理工學(xué)院，四川 自貢 643000)

近年來，隨著消費(fèi)者對(duì)食品安全問題的日益關(guān)注，食品中的各種添加劑受到人們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。人工合成的甜味劑和防腐劑作為食品添加劑被廣泛地應(yīng)用在各類食品中，但過量使用會(huì)對(duì)人體造成危害，因此，對(duì)它們的使用必須進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控[1，2]。目前，我國對(duì)食品中防腐劑和甜味劑的使用限量做了明確的規(guī)定，建立食品中防腐劑和甜味劑的含量準(zhǔn)確測(cè)定方法是十分重要的。

食醋和醬油是我國常用的調(diào)味品，山梨酸、脫氧乙酸、苯甲酸以及對(duì)羥基苯甲酸乙酯是醬油和食醋中最常見添加的防腐劑，為改善口感，向食醋和醬油中加入少量的甜味劑如糖精鈉、安賽蜜等用于調(diào)味。為保證消費(fèi)者的健康，建立一種快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)醬油和食醋中防腐劑和甜味劑的方法十分必要。目前對(duì)醬油和食醋中防腐劑和甜味劑的檢測(cè)在國標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法中均有明確的使用要求，主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、離子色譜法等[3-18]。但絕大部分方法都只能同時(shí)檢測(cè)幾種添加劑，且前處理和液相分離條件復(fù)雜。本文建立一種高效液相色譜法梯度洗脫同時(shí)測(cè)定醬油和食醋中山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、糖精鈉、安賽蜜的方法，該方法前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、精密度、準(zhǔn)確度好，有利于提高實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1.1 儀器

安捷倫1100 Series型液相色譜儀(紫外可見光檢測(cè)器)； AR1140分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；KQ3200超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；H1650R離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.1.2 試劑

苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜(1 mg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)；脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯 (99%，天津博迪化工有限公司)；乙酸銨、亞鐵氰化鉀、鹽酸、乙酸鋅(分析純)；甲醇(色譜純)；實(shí)驗(yàn)室用水，均為二級(jí)蒸餾水；微孔濾膜0.22 μm;食醋和醬油，市售。

1.2 色譜條件

Welch Xtimate C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑為5 μm)，柱溫為35 ℃，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；流動(dòng)相為甲醇(A)∶0.02 mol/L的乙酸銨溶液(B)。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱量脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯各0.1000 g于100 mL的容量瓶中用甲醇定容，每種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度為1.000 mg/mL。然后分別取各種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL于50 mL的容量瓶中，分別加入20 mL甲醇，用水定容至刻度，其濃度分別為10，20，40，80，100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，通過0.22 μm的濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)，以峰面積對(duì)樣品濃度進(jìn)行線性回歸。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取樣品5 g于25 mL的容量瓶中，依次加入0.8 mL 10%的亞鐵氰化鉀，加入0.8 mL 20%的乙酸鋅溶液，加入10 mL甲醇，最后用水定容至刻度，于離心機(jī)上轉(zhuǎn)速4000 r/min離心5 min,取清液過濾待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

用TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(jì)在190～400 nm 波長(zhǎng)下對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描。6種化學(xué)成分的最大吸收波長(zhǎng)在210～250 nm之間，糖精鈉、安賽蜜、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯的最大吸收波長(zhǎng)依次為：210，215，220，230，225，245 nm，為盡可能兼顧所有目標(biāo)化合物的靈敏度，本實(shí)驗(yàn)選用230 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。紫外-可見光譜圖見圖1。

圖1 紫外-可見光譜圖

2.2 流動(dòng)相及流動(dòng)相pH的選擇

實(shí)驗(yàn)分別采用甲醇+甲酸銨緩沖溶液、甲醇+磷酸二氫銨、乙腈+甲酸銨緩沖溶液、甲醇+乙酸銨緩沖液、乙腈+乙酸銨緩沖溶液，結(jié)果顯示：以甲醇+乙酸銨緩沖液為流動(dòng)相時(shí)，6種物質(zhì)分離效果最佳，靈敏度高，本實(shí)驗(yàn)采用乙酸來調(diào)節(jié)pH值，分別對(duì)pH 3.5，4.0，4.5，5.5，6.0進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：當(dāng)pH<4.5時(shí)，峰型有拖尾，其中1種物質(zhì)不能出峰，pH較高時(shí)出峰時(shí)間延時(shí),有2種物質(zhì)不能完全分離(見圖2)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇流動(dòng)相的酸度調(diào)節(jié)到4.5。

圖2 pH對(duì)被測(cè)物分離的影響

2.3 樣品提取溶劑的選擇

稱取一定量的樣品分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、水的提取效果，結(jié)果顯示：當(dāng)用水為提取液時(shí)，樣品與水互溶，上機(jī)檢測(cè)的色譜圖雜峰最多，分離困難；提取液為甲醇、乙醇、乙腈時(shí)，甲醇的分離效果最佳，靜置分層后清澈，上機(jī)檢測(cè)的色譜圖雜質(zhì)峰最少，無拖尾，分離度最高，因此選甲醇提取液較為理想。同時(shí)考察甲醇提取液的比例，用20%，40%，60%的甲醇溶液為提取液分別提取一定量的樣品，當(dāng)提取液為60%的甲醇溶液時(shí)，糖精鈉和安賽蜜峰型均有拖尾；用20%的甲醇溶液提取時(shí)，對(duì)羥基苯甲酸乙酯響應(yīng)值特別低，綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)采用40%的甲醇溶液為提取溶劑。

2.4 流動(dòng)相流速的選擇

流動(dòng)相的流速主要對(duì)溶質(zhì)與固定相和流動(dòng)相的相互作用有影響，從而改變待測(cè)組分的保留時(shí)間。流速太快，可能導(dǎo)致柱壓過高，引起漏液；流速太慢，會(huì)增加待測(cè)物的保留時(shí)間，容易引起色譜峰拖尾現(xiàn)象。所以實(shí)驗(yàn)過程中要選擇合適的流速，保持其他條件不變，改變流動(dòng)相的流速為0.5，0.6，0.8，1.0，1.2 mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：流速低于0.6 mL/min時(shí)出峰時(shí)間延遲，有拖尾現(xiàn)象；流速超過1.2 mL/min時(shí)柱壓過高，出峰太快，分離效果不佳。綜合考慮樣品的分離度和分析時(shí)間，最終選定流速為1.0 mL/min,6種物質(zhì)能完全分離。

2.5 線性范圍與檢出限

在確定的實(shí)驗(yàn)條件下，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度C(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性方程，見圖3。按信噪比(S/N)=3計(jì)算最低檢出限(LOD)，為0.15～0.23 mg/L，見表2。

圖3 6種被測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

化合物線性回歸方程相關(guān)系數(shù)R2檢出限(mg/L)苯甲酸 y=16.202x+1.92060.99960.15安賽蜜 y=24.001x+3.83610.99980.17山梨酸y=18.728x-2.41240.99970.18脫氫乙酸 y=8.4849x+2.92890.99970.22對(duì)羥基苯甲酸乙酯y=11.82x+4.97530.99940.23糖精鈉 y=3.5805x+0.56190.99980.20

由圖3和表2可知，該方法對(duì)6種待測(cè)化合物具有較寬的線性范圍且具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)≥0.9994。

2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果

按照上述樣品的制備方法分別處理醬油和食醋樣品，根據(jù)液相色譜分析條件檢測(cè)各個(gè)樣品溶液，測(cè)得峰面積，帶入回歸方程，計(jì)算得到樣品含量結(jié)果，見表3。結(jié)果表明：5種醬油中均檢測(cè)出添加防腐劑，2種添加甜味劑，5種食醋中檢測(cè)出3種添加防腐劑，圖4中a，b，c 分別為6種被檢測(cè)物質(zhì)、1種醬油和食醋的色譜圖。

表3 樣品檢測(cè)結(jié)果 g/L

注：ND為未檢出。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖

2.7 加標(biāo)回收率與精密度

本實(shí)驗(yàn)采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，對(duì)食醋樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加3個(gè)質(zhì)量濃度水平的標(biāo)樣溶液：10，40，80 μg/mL，按照以上設(shè)定的實(shí)驗(yàn)方法，分別測(cè)定其含量，不同濃度水平樣品進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出加標(biāo)回收率和精密度。

表4 6種被檢測(cè)物質(zhì)加標(biāo)回收率和精密度

由表4可知，目標(biāo)化合物的平均回收率為97.24%～103.50%，RSD為1.45%～2.89%，結(jié)果表明：該方法的精密度和回收率都符合國內(nèi)外的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

3 結(jié)論

本文建立了采用高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)醬油和食醋中6種添加劑的方法，各個(gè)待測(cè)組分均具有良好的分離度、精密度和準(zhǔn)確度，該方法操作簡(jiǎn)單、快速且成本較低，符合相應(yīng)的檢測(cè)需求，適用于實(shí)驗(yàn)室中大批量樣品的檢測(cè)。