張娟 ，付嘉釗 ，王路敏 李艷萍 江紅 ，夏俊杰 齊忠權(quán) （1.廈門大學(xué)器官移植研究所，福建 廈門 110；.福建省器官與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 110；.上海市同濟(jì)醫(yī)院，上海 000；.上海長海醫(yī)院，上海 00；.福建省微生物研究所，福建 福州 0000；.廣西大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 000）

免疫抑制劑的開發(fā)與運(yùn)用一直推動著器官移植領(lǐng)域的發(fā)展［1］。自Edmonton方案被提出以后，移植領(lǐng)域發(fā)生了質(zhì)的飛躍［2］，尤其是雷帕霉素與他克莫司的開發(fā)與利用，使得該方案得到廣泛的認(rèn)可與臨床運(yùn)用。近年來，雷帕霉素廣泛應(yīng)用于器官移植術(shù)后排斥反應(yīng)治療中，包括抑制皮膚、心臟、腎臟、肝臟等器官移植后的排斥反應(yīng)［3-5］。隨著研究的不斷深入，研究者們發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑在延長移植物存活時(shí)間的同時(shí)［6-7］，也給胰島本身帶來了嚴(yán)重的毒性作用，包括抑制胰島細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰島細(xì)胞調(diào)亡、抑制胰島細(xì)胞分泌胰島素等［8-16］。依維莫司作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床時(shí)也會誘發(fā)高血糖的現(xiàn)象［17-20］。因此，如何避免免疫抑制劑對胰島的毒副作用從而延長胰島移植物的存活，是胰島移植面臨的一大難題。雷帕霉素是胰島移植應(yīng)用中最常用的免疫抑制劑之一，但是系列研究表明它對胰島本身存在一定毒性作用，所以新型免疫抑制劑的開發(fā)迫在眉睫。

依維莫司、地磷莫司、佐他莫司是雷帕霉素的衍生物，隨著雷帕霉素對腫瘤及移植的作用不斷被開發(fā)和深入探討，這幾種衍生物的開發(fā)也相繼問世。其中依維莫司在臨床器官移植中較多見，已經(jīng)應(yīng)用于腎［21］、心［22］、肝［23］、肺［24］及胰島移植［25-26］，但是地磷莫司、佐他莫司、替西羅莫司在移植領(lǐng)域研究甚少，尤其是對胰島的研究。本文首次詳細(xì)闡述并對比3種雷帕霉素衍生物（依維莫司、地磷莫司、佐他莫司）對胰島的毒性作用。通過體外實(shí)驗(yàn)來研究雷帕霉素的3種衍生物對胰島是否具有毒性。進(jìn)一步探討雷帕霉素衍生物是否能避免胰島毒性而更能優(yōu)于雷帕霉素在移植領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠胰島素瘤細(xì)胞（MIN6細(xì)胞）培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、0.01%β-巰基乙醇和1%青鏈霉素。

1.2 主要試劑：雷帕霉素（LClabs）、依維莫司、地磷莫司、佐他莫司（福建微生物研究所饋贈），環(huán)孢素A（Selleck），三氧化二砷（北京雙鷺），細(xì)胞增殖檢測試劑盒（Roche），Annexin V調(diào)亡檢測試劑盒（BD PharMingen），碘化丙啶（propidiμm iodide，PI）（Sigma），Rnase酶（天根生化科技有限公司），細(xì)胞增殖及毒性檢測試劑盒（CCK8，全式金），小鼠胰島素檢測試劑盒（Millipore）。

1.3 免疫抑制劑的配制：雷帕霉素配制需稱取1 mg雷帕霉素，用99.9%無水乙醇配制成濃度為1 mg/ml的儲存液，0.22 μm的過濾器過濾，保存于-80℃冰箱，再用DMEM培養(yǎng)基稀釋成工作液濃度，保存于-20℃冰箱備用。依維莫司、地磷莫斯、佐他莫司、環(huán)孢素A配制同前。

1.4 免疫抑制劑的濃度：雷帕霉素及其衍生物設(shè)100 μg/L為研究濃度，環(huán)孢素A濃度為10 mg/L作為陽性對照。

1.5 檢測細(xì)胞的增殖能力：MIN6細(xì)胞接種至96孔平底培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，饑餓24小時(shí)；之后分組刺激細(xì)胞，按照雷帕霉素、衍生物以及環(huán)孢素A的濃度，各組設(shè)置3個副孔，培養(yǎng)48小時(shí)。按5-溴脫氧尿嘧啶核苷法（5-bromo-2-deoxyuridine， BrdU）提供的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.6 檢測細(xì)胞活力：細(xì)胞準(zhǔn)備同前。檢測前加入10% CCK8（即每孔加入 10 μl CCK8，90 μl完全培養(yǎng)基），繼續(xù)放入5% CO2培養(yǎng)箱續(xù)培養(yǎng)1 ～ 4小時(shí)，注意觀察培養(yǎng)基的顏色，若各組間顏色差異明顯則可準(zhǔn)備上機(jī)檢測。在450 nm波長處測定吸光度（A）值。

1.7 PI檢測細(xì)胞周期：準(zhǔn)備細(xì)胞后，雷帕霉素及其衍生物（100 μg/L）刺激細(xì)胞48小時(shí)，PI染色，過濾，上機(jī)檢測（Partec流式細(xì)胞儀）。

1.8 Annexin V/PI雙染法檢測MIN6細(xì)胞的調(diào)亡：雷帕霉素及其衍生物（100 μg/L）和三氧化二砷（5 μmol/L）刺激細(xì)胞48小時(shí) ；按照BD FITC Annexin V細(xì)胞調(diào)亡試劑和提供的說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.9 檢測細(xì)胞分泌胰島素功能：準(zhǔn)備細(xì)胞。加藥處理培養(yǎng)48小時(shí)，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 清洗細(xì)胞，KRBH液平衡30分鐘，再換用含葡萄糖濃度為2.8 mmol/L 和16.7 mmol/L的KRBH液500 μl，37℃孵育1小時(shí)，分別作為基礎(chǔ)胰島素分泌（basic insulin secretion，BIS）和糖刺激的胰島素分泌（glucose stimulated insulin secretion，GSIS），收集上清液。后續(xù)根據(jù)Millipore試劑盒的步驟進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：體內(nèi)試驗(yàn)各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重檢驗(yàn)采用Bonferroni校正。各組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均出自GraphPad Prism?5軟件計(jì)算結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 雷帕霉素衍生物抑制MIN6細(xì)胞增殖（圖1）：我們用100 μg/L的藥物濃度處理細(xì)胞48小時(shí)，與陰性對照（無水乙醇）相比，發(fā)現(xiàn)依維莫司、地磷莫司、佐他莫司和雷帕霉素一樣，都會抑制細(xì)胞增殖，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 雷帕霉素及衍生物對MIN6細(xì)胞增殖的影響

2.2 雷帕霉素衍生物抑制MIN6細(xì)胞活力（圖2）：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對照（無水乙醇）相比，3種衍生物與雷帕霉素均能抑制細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 雷帕霉素衍生物在MIN6細(xì)胞周期中的研究（圖3）：結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生物與溶劑無水乙醇相比，都有增加G1期的比例和減少S期比例的趨勢，但差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這種趨勢也與上述增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果得到相互印證。雷帕霉素及其衍生物也許通過抑制細(xì)胞周期，抑制了MIN6細(xì)胞的增殖。

圖2 雷帕霉素及衍生物對MIN6細(xì)胞活力的影響

圖3 雷帕霉素及衍生物對MIN6細(xì)胞周期的影響

2.4 雷帕霉素衍生物對MIN6細(xì)胞調(diào)亡的影響（圖4）：三氧化二砷作為陽性對照（本實(shí)驗(yàn)室通過前期研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷能明顯促進(jìn)細(xì)胞調(diào)亡，因此我們選擇三氧化二砷作為陽性對照，其濃度為5 μm/L）。通過上述實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)3種衍生物均抑制細(xì)胞的增殖和活力，作為陽性對照的三氧化二砷明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞調(diào)亡，而雷帕霉素及其衍生物也不同程度地誘導(dǎo)了MIN6細(xì)胞的調(diào)亡，雖然調(diào)亡細(xì)胞比例稍大于無水乙醇作用下MIN6細(xì)胞調(diào)亡的比例，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雷帕霉素、依維莫司、地磷莫司、佐他莫司4種藥之間相比，對MIN6細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)也無明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷帕霉素及其衍生物也許并非通過誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞調(diào)亡來抑制其增殖和細(xì)胞活力。

圖4 雷帕霉素及衍生物對MIN6細(xì)胞調(diào)亡的影響

2.5 雷帕霉素衍生物抑制MIN6細(xì)胞分泌胰島素（圖5）：雷帕霉素對胰島的毒性主要是抑制胰島細(xì)胞分泌胰島素，所以接下來我們研究3種雷帕霉素衍生物對胰島素分泌功能的影響。實(shí)驗(yàn)中，我們分別加入低濃度和高濃度的葡萄糖來刺激細(xì)胞分泌胰島素，得到結(jié)果顯示雷帕霉素及3種衍生物與陰性對照組相比，明顯抑制MIN6細(xì)胞分泌胰島素的功能。

圖5 雷帕霉素及其衍生物抑制MIN6細(xì)胞分泌胰島素

3 討 論

隨著Edmonton方案的問世，胰島移植獲得了巨大的進(jìn)步，雷帕霉素也被越來越多的運(yùn)用及研究。免疫抑制劑的廣泛開發(fā)及應(yīng)用也給移植領(lǐng)域帶了新的生機(jī)與希望［27］。但免疫抑制劑本身在發(fā)揮抑制免疫的優(yōu)勢時(shí)，同時(shí)也帶來了諸多不良反應(yīng)。雷帕霉素在發(fā)揮其免疫抑制作用來延長胰島移植物生存期的同時(shí)，也加重了其對胰島的損傷。

雷帕霉素對胰島的毒性主要體現(xiàn)在影響細(xì)胞增殖、活力、調(diào)亡以及分泌胰島功能等方面,而依維莫司、地磷莫司、佐他莫司是雷帕霉素的最常見的3種衍生物，這3種衍生物對胰島是否具有毒性作用，至今鮮有研究。所以我們研究了3種雷帕霉素衍生物對MIN6細(xì)胞的增殖、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、調(diào)亡以及分泌胰島素功能的影響。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)3種雷帕霉素衍生物與雷帕霉素一樣，均能抑制細(xì)胞增殖及細(xì)胞活力，同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)它們也能明顯抑制細(xì)胞分泌胰島素的功能，但是對細(xì)胞周期及調(diào)亡并無明顯意義。我們分析了藥物影響細(xì)胞增殖的原因，認(rèn)為3種衍生物的細(xì)胞周期和調(diào)亡或許并不是直接導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制的主要原因。

依維莫司、地磷莫司、佐他莫司這3種衍生物均對胰島具有毒性。雷帕霉素衍生物對胰島產(chǎn)生毒性的作用機(jī)制和它們是否可以替代雷帕霉素在Edmonton方案中的角色有待進(jìn)一步研究。