宋紅麗，楊洋，尹明麗，鄭衛(wèi)萍，劉濤，董沖，沈中陽（.天津市第一中心醫(yī)院器官移植外科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，天津3009；.天津市第一中心醫(yī)院，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室，天津 3009）

小腸移植（small bowel transplantation，SBT）是公認的能夠挽救小腸功能衰竭合并全胃腸外營養(yǎng)并發(fā)癥患者的有效治療手段［1-2］。但由于小腸富含淋巴組織以及腸腔內(nèi)存在大量細菌，小腸移植排斥反應明顯，目前尚無有效的控制手段。現(xiàn)有的免疫抑制治療效果不佳，并會帶來一些相應的風險，如惡性腫瘤、感染及高額費用等，這些將會嚴重影響小腸移植受者長期的存活率，也制約了小腸移植事業(yè)的發(fā)展。免疫耐受是一種受體免疫系統(tǒng)對移植物長期特異性的不應答狀態(tài)，仍然具有正常的針對其他外來抗原的免疫應答能力。因此，如何誘導一種持久穩(wěn)定且無需藥物的免疫耐受是迫切需要解決的問題［3］。

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC）在器官移植中具有重要的應用價值［4］。BMMSC具有低免疫原性，對于抑制器官移植后T細胞介導的免疫排斥具有一定的效果［5-6］。其能夠通過分泌一些免疫抑制細胞因子如白細胞介素 -10（interleukin-10，IL-10）、轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等以及干擾輔助性T淋巴細胞的分化來誘導免疫耐受［7-8］，是一種具有應用前途的治療方法。但也有報道單純BMMSC輸注在組織內(nèi)的活性偏低［9］，而研究證明，應用基因工程方法干預BMMSC的基因表達是一個有效的方法［10］。血紅素加氧酶1（hemeoxygenase 1， HO-1）是一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的活性因子，參與器官移植后免疫耐受的調(diào)控過程［11］。HO-1可以轉染到BMMSC上，并增強BMMSC的活性，從而增強其免疫調(diào)節(jié)和抗氧化能力，同時還可以延長其作用時間［12］。

本研究在單純應用BMMSC保護小腸移植排斥反應的基礎上，以腺病毒為載體將大鼠HO-1基因體外轉染BMMSC形成HO-1/BMMSC，研究其對大鼠異位小腸移植排斥反應的影響，探討HO-1是否能增強BMMSC在移植免疫中的調(diào)節(jié)作用以及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和實驗器材：DMEM/F12（1：1）培養(yǎng)基（Hyclone，美國），胎牛血清（PAA，澳大利亞），谷氨酸胺、青霉素/鏈霉素雙抗混合液（Gibco，美國），胰蛋白酶消化液、二甲基亞砜、磷酸鹽緩沖溶液（Sigma，美國），10×紅細胞裂解液（BD，美國），大鼠IL-10、TGF-β、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細胞介素 -17（interleukin-17，IL-17）、白細胞介素-23 （interleukin-23，IL-23）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（Santa cruz biotechnology，美國），表達大鼠HO-1的重組腺病毒 （上海吉凱基因化學技術有限公司，中國）。Leica c0269手術顯微鏡（Leica microsystems AG，德國），顯微手術器械 （金鐘醫(yī)療器械，中國），正置熒光顯微鏡（Nikon Ni-U，日本），流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國），酶標儀（Bio Tek Synergy 2，美國）。

1.2 實驗動物、分組及處理：實驗動物購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF級健康雄性BN大鼠（RT-1n）及雄性Lewis大鼠（RT-11），BN大鼠體重180～200 g，Lewis大鼠200～220 g。動物購進后置于光照與黑暗每12小時循環(huán)的環(huán)境，適應性喂養(yǎng)7天。以BN大鼠為供體，Lewis大鼠為受體，建立異基因（allogeneic，Allo）急性排斥反應模型，實驗鼠術后經(jīng)陰莖背靜脈注射生理鹽水或細胞，供受體術前分別禁食24小時和12小時。實驗分為生理鹽水 （NS） 組、BMMSC組和HO-1/BMMSC組，每組分別在0、1、5、7、10天各個時間點分配5只實驗鼠。實驗各組均選擇輸注細胞5×106/ml劑量（1 ml/只鼠），對照組輸注NS（1 ml/只鼠）。觀察移植術后各個時間點分別處死的實驗大鼠，收集外周靜脈血及組織標本。

1.2.1 異位小腸移植動物模型的建立方法同之前的研究［7］。將供體小腸的腸系膜上動脈及門靜脈分別于受體大鼠的腹主動脈及下腔靜脈做端側吻合。吻合完畢后開放血流，于下腹兩側腹壁分別戳孔將移植腸兩斷端牽引出腹腔行造瘺。溫生理鹽水沖洗腹腔后關腹?？緹艏訙乇Ｅ潦荏w大鼠清醒。

1.2.2 受體術后護理：術后給予單籠喂養(yǎng)，清醒后即可自由飲水，12小時后給予自由進食。定期清洗消毒籠具并更換敷料保持清潔。每天至少巡視3次，對堵塞的造瘺口進行護理。觀察移植大鼠術后的生存狀態(tài)并記錄各組大鼠生存時間。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMMSC的提取、培養(yǎng)以及HO-1轉染BMMSC與驗證的方法參照我們之前的研究［10］。應用免疫細胞化學熒光染色檢測HO-1/BMMSC中HO-1的表達，步驟如下：將滅菌后的蓋玻片置于無菌的培養(yǎng)皿底部，取5 ml 腺病毒載的HO-1轉染的BMMSC懸液（密度為1×106/ml）加入培養(yǎng)皿進行爬片；待細胞生長融合后用PBS漂洗3次；4%多聚甲醛處理20分鐘，漂洗；0.5% Txiton X-100室溫處理20分鐘，漂洗；3% H2O2室溫處理15分鐘，漂洗；100 ml/L正常羊血清封閉液封閉l小時；在玻片上滴加濃度為1：100的兔抗鼠HO-1抗體，4℃冰箱過夜；漂洗后滴加濃度為1：400的PE標記的羊抗兔免疫熒光抗體，37℃水浴箱中避光孵育1小時；漂洗后封片，于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光。

1.3.2 組織病理學檢測及急性排斥反應評分：分別于術后1、5、7、10天搜集各組移植腸標本行組織病理學檢測，光學顯微鏡觀察組織病理學改變，按急性排斥評分標準對各組大鼠各時間點排斥反應程度進行評分并進行統(tǒng)計學分析。

光學顯微鏡下隨機選擇5個視野觀察兩組動物在各時間點的病理改變，并根據(jù)Wu等［13］報道的小腸移植排斥評分標準進行排斥反應評分。此標準依據(jù)黏膜層及黏膜下層細胞浸潤、腺窩上皮損傷、腺窩調(diào)亡小體形成、結構破壞及黏膜潰瘍程度，將小腸移植排斥反應程度劃分為不明確的、輕度的、中度的以及重度的排斥反應。

1.3.3 受體大鼠NK細胞活性檢測：提取各組受體鼠脾臟淋巴細胞與靶細胞YAC-1細胞共培養(yǎng)，通過測定乳酸脫氫酶的釋放量計算NK細胞的活性，統(tǒng)計學分析各組間差異。

1.3.4 免疫相關細胞因子檢測：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）檢測各組大鼠在各時間點血清的IL-10、TGF-β、IL-2、IL-17、IL-23及TNF-α的水平。具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.3.5 流式細胞術檢測脾臟Tregs水平：分離受體鼠脾淋巴細胞，PBS重懸至1×107/ml，取0.1 ml分別加入抗 CD4 抗體 0.5 μl，抗 CD25 抗體 0.625 μl，4℃避光孵育30分鐘。PBS洗滌后加入穿孔素1 ml，4℃避光孵育過夜。PBS洗滌并定容至0.1 ml，加入抗Foxp3抗體5 μl，4℃避光孵育2小時。PBS洗滌后固定于4%的多聚甲醛等待上機檢測。流式細胞術檢測其中CD4+、CD25+、Foxp3+和Tregs的變化，統(tǒng)計學分析各組間差異。

1.4 統(tǒng)計分析：用GraphPad Prism 5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析和圖片制作，應用SPSS統(tǒng)計學軟件（19.0版）進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)比較如為兩組間的，則用Student'st檢驗；如為3組及以上，則用單因素方差分析 （One-Way ANOVA）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 體外提取BMMSC和制備HO-1/BMMSC

2.1.1 大鼠BMMSC的培養(yǎng)和鑒定：體外成功培養(yǎng)和擴增出大鼠BMMSC。可從以下三個方面對其進行鑒定：① 細胞貼壁生長，傳代后的細胞呈長梭形，部分呈漩渦或菊花狀排列，具備典型的BMMSC形態(tài)特征 （圖1a）。② 細胞能夠誘導分化成為脂肪細胞（油紅O染色顯示胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴，圖1b）和成骨細胞（von Kossa染色顯示細胞中出現(xiàn)黑色鈣鹽） （圖1c）。③ 細胞表面標記檢測顯示CD29+CD34-、CD90+CD45-和 RT1A+RT1B-的陽性率分別為99.5%、99.8%和98.5% （圖1g，h，i）。

2.1.2 重組腺病毒載體能夠成功介導HO-1基因到BMMSC中：用表達HO-1基因的重組腺病毒感染BMMSC，Ad-GFP作為對照。感染后48小時觀察細胞，熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)細胞中綠色熒光表達陽性率＞80% （圖1d），免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Adv-HO-1/BMMSC組紅色標記的HO-1表達量明顯高于單純Adv/BMMSC 組（圖 1e ～ f），HO-1基因表達明顯上調(diào)，表達量約為對照細胞的5倍。以上這些結果表明腺病毒介導的HO-1成功在BMMSC中過表達。HO-1轉染成功，為下一步實驗打下基礎。

圖1 BMMSCs形態(tài)、特性、表型及轉染HO-1

2.2 大鼠小腸移植排斥反應模型建立成功

2.2.1 一般表現(xiàn)和生存時間：BMMSC治療在一定程度上減輕了移植大鼠的急性排斥癥狀，受體大鼠的精神狀態(tài)、活動以及對外界刺激的反應均有一定程度的好轉，生存率也有顯著提高，但總體效果還是不太令人滿意。HO-1/BMMSC組的觀察結果則十分令人鼓舞，在整個觀察期內(nèi)，大部分受體鼠的生存狀況良好，沒有出現(xiàn)典型的急性排斥反應癥狀。各組的中位生存時間分別為：NS組10天、BMMSC組15天和HO-1/BMMSC組24天。HO-1/BMMSC治療進一步提高了移植大鼠的生存率，與BMMSC組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.2.2 各組移植小腸的病理表現(xiàn)（圖2）：NS組移植腸表現(xiàn)為進行性加重的急性排斥反應。黏膜及黏膜下層逐漸加重的炎性細胞浸潤，腺窩上皮損傷及調(diào)亡小體形成，小腸絨毛破壞以及黏膜潰瘍出血。BMMSC組移植腸在5天及7天時的病理改變大大減輕，一般僅有少至中等量的炎性細胞浸潤以及有限的腺窩上皮損傷及調(diào)亡等輕至中度的排斥反應表現(xiàn)，而10天時雖然也相對好轉，但依然表現(xiàn)出中至重度的急性排斥反應。HO-1/BMMSC治療組在各時間點的病理學表現(xiàn)較BMMSC組明顯改善，特別是在第10天，僅有少數(shù)發(fā)展為中度急性排斥反應。

圖2 各組移植小腸病理表現(xiàn)（100×）

2.3 BMMSC過表達HO-1誘導大鼠脾臟Treg細胞高水平持久表達：經(jīng)流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)，BMMSC 治療顯著增加了 CD4+、CD25+、Foxp3+和Tregs的表達水平，在7天時達到峰值，10天時出現(xiàn)回落現(xiàn)象（圖3a）。HO-1/BMMSC組Tregs水平呈現(xiàn)快速穩(wěn)步上升，10天時依然保持在高水平。統(tǒng)計學分析顯示，HO-1/BMMSC組較BMMSC組進一步提高了Tregs表達，尤其在第10天，差異具有統(tǒng)計學意義（圖3b）。

圖3 受體脾中Tregs水平

2.4 過表達HO-1增強BMMSC對大鼠血清中細胞因子的調(diào)節(jié)（圖4）：ELISA檢測結果發(fā)現(xiàn)，HO-1/BMMSC組血清IL-10及TGF-β等與抗炎或Tregs分化相關的細胞因子表達水平較對照組進一步升高。而與促炎或Th17分化相關的細胞因子IL-2、TNF-α及IFN-γ上升幅度較BMMSC組顯著縮小，僅有小幅上升，IL-6、IL-17及IL-23呈現(xiàn)下降或較小幅度的波動，而不是如BMMSC組出現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且總體水平較BMMSC組表達水平則明顯降低。差異具有統(tǒng)計學意義。

圖4 血清中各細胞因子水平（與NS組相比，aP＜0.05；與BMMSC組相比，bP＜0.05；與HO-1/BMMSC相比，cP＜0.05）

2.5 過表達HO-1增強BMMSC對大鼠NK細胞活性的抑制（圖5）：BMMSC的治療雖顯著抑制了NK細胞活性，但在7天和10天時，NK細胞活性依然呈現(xiàn)較大幅度的上升趨勢， BMMSC組大致情況與此類似。HO-1/BMMSC組NK細胞活性在觀察期內(nèi)則無明顯大幅上升趨勢，僅僅是圍繞正常水平上下波動。統(tǒng)計分析結果表明，NK細胞活性在HO-1/BMMSC組進一步降低至接近正常范圍，差異具有統(tǒng)計學意義。

圖5 NK細胞活性

3 討 論

盡管隨著新型免疫抑制劑的問世和不斷發(fā)展，目前臨床小腸移植排斥反應得到了較好的控制，但排斥反應的發(fā)生率依然很高。有報道稱小腸移植術后的急、慢性排斥反應的發(fā)生率分別可達90%及30%～50%［14］。而長期使用免疫抑制劑增加了發(fā)生高血壓、腎毒性、神經(jīng)毒性、術后腫瘤以及代謝性疾病等不良反應的風險［15］。因此，尋找一種全新的不良反應少的免疫抑制策略顯得尤為必要。

由于干細胞（mesenchymal stem cell， MSC）具有低免疫原性、較低的抗原提呈能力以及獨特的免疫調(diào)節(jié)作用，使其能夠在體內(nèi)及體外影響免疫系統(tǒng)，如T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞以及樹突狀細胞［16-18］，從而逃避免疫識別，抑制免疫應答［19］。目前，MSC已經(jīng)被應用于幾乎所有的器官移植基礎研究中，同時發(fā)現(xiàn)體內(nèi)移植的MSC具有歸巢的特點，在多種因素的作用下，外源性的或自體的MSC能夠定向趨向性遷移并定植于靶向組織［20-21］。并被證實在減輕移植免疫及誘導器官移植免疫耐受上發(fā)揮重要作用［22］。

MSC能夠遷移至炎癥性的結腸并發(fā)揮抗炎及調(diào)節(jié)免疫的作用［23］，但其腸道定植率極低，MSC被認為至少是部分通過旁分泌發(fā)揮治療作用的。同時，由于局部組織的缺血、缺氧以及炎癥反應，MSC移植后的存活率極低，移植后4天存活的細胞數(shù)量明顯下降，而只有不到1%的細胞存活超過1周［24］。無論MSC是通過何種途徑發(fā)揮其再生、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用的，其效應均嚴重受限于體內(nèi)低下的生存率。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，BMMSC雖然減輕了小腸移植大鼠的急性排斥反應，但這種效應維持的時間較為有限，一般在7天內(nèi)效果比較顯著，而7天后便大大減弱。病理學檢測10天時，BMMSC治療組組織結構破壞嚴重，大量炎性細胞浸潤，調(diào)亡細胞較前顯著增多，表現(xiàn)為中至重度的排斥反應。排斥評分雖較NS組降低，但受體鼠的生存狀況及病理學改變均較前顯著加重。各種檢測結果提示，BMMSC組在抑制NK細胞活性、調(diào)節(jié)細胞因子表達水平以及誘導Tregs生成等方面均不能維持1周內(nèi)的良好態(tài)勢。這均與BMMSC移植體內(nèi)1周后存活率顯著降低有關。為了改善BMMSC移植體內(nèi)后的生存率，我們的研究引入了HO-1這種細胞保護性的基因。

HO-1是HO的誘導型，是一種細胞保護性酶，通過發(fā)揮抗炎、抗調(diào)亡、抗氧化應激以及抗缺血/再灌注損傷等效應而起到保護細胞的作用［25-27］。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1對各種原因引起的腸道損傷同樣具有保護及修復作用，其主要機制包括抗氧化、抗炎、抗調(diào)亡以及調(diào)節(jié)微循環(huán)的作用等［28-30］。另外，HO-1對MSC具有調(diào)控作用，能夠在缺氧和氧化應激狀態(tài)下減輕MSC的調(diào)亡［31］。然而，在器官移植的研究中，HO-1亦具有減輕排斥反應、延長移植物存活時間甚至誘導移植物免疫耐受的作用［32-33］。本研究將HO-1通過基因工程修飾BMMSC，一方面希望借助這種具有細胞保護作用的酶能夠提高BMMSC在小腸移植大鼠體內(nèi)的存活率，另一方面希望HO-1與BMMSC兩者的免疫抑制效應疊加，從而發(fā)揮更強大的免疫抑制效應，進而更好地控制小腸移植排斥反應。結果發(fā)現(xiàn)，小腸移植排斥反應中，NK細胞是參與其中的效應細胞之一，使用未處理的BMMSC治療時，NK細胞的活性雖有顯著降低，但依然呈現(xiàn)出上升的趨勢，而使用HO-1基因轉染的細胞治療后，NK細胞的活性被抑制在正常范圍內(nèi)，并沒有出現(xiàn)大幅度地升高，我們推測這是因為BMMSC在體內(nèi)的存活時間延長發(fā)揮了更持久的免疫抑制作用，同時也可能與過表達的HO-1的免疫調(diào)節(jié)相關。

器官移植中移植物排斥反應是由T細胞介導的針對供體抗原的免疫反應，Th1、Th2、Th17及Tregs 等CD4+的Th細胞分別發(fā)揮著不同的免疫效應，Th1/Th2及Th17/Treg的比率在調(diào)節(jié)T細胞免疫反應中發(fā)揮重要的作用［34］。Th1細胞主要分泌IL-2、IFN-γ以及TNF-α，而Th2細胞主要分泌IL-4、IL-10以及IL-13。Th1/Th2比率及二者相關細胞因子常被用來解釋器官移植免疫相關現(xiàn)象［35］。Th17細胞的特點是分泌細胞因子IL-17、IL-21及IL-22［36］，其分化需要 TGF-β 和 IL-6 的參與［37］，其表型的穩(wěn)定需要 IL-23、TNF-α及IL-1β［38］。Tregs則通過分泌IL-10及TGF-β產(chǎn)生抗炎效應及促進自我耐受。Th17細胞及其細胞因子IL-6、IL-17及IL-23可能介導移植排斥［39］。而Tregs則可能阻止排斥反應的發(fā)生，甚至誘導并維持免疫耐受［40］。MSC的免疫調(diào)節(jié)作用與Tregs的擴增相關，其中一些研究中MSC可以誘導Foxp3+和Tregs依賴性的免疫耐受［41］。本研究中，炎癥相關性細胞因子以及Th分化相關的細胞因子在BMMSC與HO-1/BMMSC治療作用下均發(fā)生顯著變化。具體來說，IL-10和TGF-β的濃度顯著升高，而 IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ濃度顯著降低。不同的是，與單純BMMSC組相比，HO-1/BMMSC組中升高IL-10、TGF-β以及降低IL-2、IL-6、IL-17、IL-23、TNF-α及IFN-γ 濃度更顯著，甚至不同程度地逆轉了IL-6、IL-17和IL-23的上升趨勢。Tregs的變化也十分顯著，HO-1/BMMSC不僅進一步上調(diào)了Tregs的表達，而且其高水平表達更為穩(wěn)定持久。我們推測以上這些效應與HO-1保護BMMSC并增強其免疫調(diào)節(jié)的作用有關。

總之，本研究中與單獨BMMSC相比，HO-1/BMMSC組對小腸移植排斥反應的抑制作用更強大更持久。主要是通過抑制免疫細胞如NK細胞、Treg細胞和細胞因子發(fā)揮作用的。