趙越 ，徐雙悅韓蔚民莊國洪齊忠權 （.廈門大學器官移植研究所，福建省器官與再生重點實驗室，福建 廈門 6005；.廈門大學附屬中山醫(yī)院肝膽外科，慢性肝病肝癌重點實驗室，福建 廈門 6005；.廣西大學醫(yī)學院，廣西壯族自治區(qū) 南寧 50004）

器官移植被認為是治療器官衰竭的最有效手段［1-3］，然而，移植后的免疫排斥反應一直是影響移植物生存的主要障礙［4-5］。目前，通過抑制急性排斥反應，能夠較好地延長移植物的生存期。T細胞介導的免疫反應在急性免疫排斥反應中起到了重要的作用［6-7］。因此，深入研究免疫排斥反應的分子機制，有利于臨床尋找新的靶點治療，緩解T細胞介導的急性免疫排斥反應，從而延長移植物的生存期。

腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8樣因子-2（tumor necrosis factor-α-induced Protein-8-like-2，TN-FαIP8L2/TIPE2）是腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8家族成員之一，作為免疫負調控分子，它在固有免疫以及細胞免疫中發(fā)揮著重要作用［8］。TIPE2主要在免疫系統(tǒng)中高表達，具有維持免疫平衡和防止免疫過反應的作用。已有文獻報道顯示，TIPE2主要在淋巴組織中高表達，但是在內分泌組織和骨骼肌中也可以檢測到TIPE2的表達［9］，而在眾多的腫瘤細胞系中TIPE2不表達或是表達量低。近幾年，越來越多文獻報道TIPE2與腫瘤的增殖、轉移等相關［10-12］。

在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者中，TIPE2在外周血單個核細胞中表達量明顯下降，說明TIPE2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制中至關重要［13］。在移植方面，有文獻表明相對于正常腎組織，慢性排斥組的腎移植物TIPE2表達量明顯下降，急性排斥反應組TIPE2表達量輕微下降［14］。但在心臟移植中TIPE2的表達情況以及作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，同種異體心臟移植物中TIPE2表達量上升，這與浸潤心臟內的T細胞有關，提示了TIPE2與T細胞介導的急性免疫排斥反應可能具有一定的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料：8 ～ 12周雌性C57BL/6以及BALB/c小鼠（上海Slac實驗動物有限公司）；流式抗體FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8（美國Biolegend公司）；免疫熒光抗體anti-CD4、anti-CD8、anti-TIPE2（加拿大Invitrogen公司）；FITC和PE標記的抗兔抗體（加拿大Invitrogen公司）；實時定量PCR反轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應擴增試劑盒及TRIzol（日本Takara公司）；全部引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠心臟移植：我們實施的是血管異位心臟移植術，將供體心臟的主動脈及肺動脈與受體的頸總動脈及頸外靜脈采取套管法連接［15］。實驗分為兩組（同種同系組和同種異系組），同種同系組（n＝3）：將C57BL/6小鼠的心臟異位移植到另一只C57BL/6小鼠頸部；同種異系組（n＝3）：將BALB/c小鼠的心臟異位移植到C57BL/6小鼠頸部。

1.2.2 流式細胞術檢測心臟移植物中CD4+與CD8+T細胞：同種同系組及同種異系組小鼠心臟移植物在第7天取出，研磨勻漿后過濾，標記FITC-anti-CD4、PE-anti-CD8抗體，標記好后用來自德國Partec 公司的FACScan儀器進行檢測，所獲得數(shù)據(jù)通過FlowJo軟件進行處理。

1.2.3 心臟移植物切片及HE染色：第7天時取出受體小鼠的心臟移植物，浸泡在10%福爾馬林中，石蠟包裹后切成5 μm的切片，最后用HE染色制片。

1.2.4 免疫熒光：同種異系組小鼠脾臟在移植后7天取出，研磨提取脾細胞后涂片，用4%多聚甲醛泡15分鐘，PBS洗滌液洗兩次，然后用0.2%Triton X-100沖洗5分鐘。5%脫脂牛奶阻斷30分鐘，然后用CD4、CD8及TIPE2多克隆抗體4℃孵育過夜，過夜后切片用FITC和PE標記的抗兔抗體37℃黑暗孵育1小時。然后，（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色。最后，通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察。

1.2.5 Real-time PCR檢測TIPE2、白細胞介素-2（interleukin-2，IL-2）和γ-干擾素（interferon-γ，INF-γ）的表達：引物序列設計：TIPE2上游引物為5'- CACCCAAGTCACATGACCGC-3'，下游引物為 5'- GAGCCCATCACAGATCTTGC- 3'， IL-2 上游引物為 5'- GGAGCAGCTGTTGATGGACCTAC -3'，下游引物為5'- AATCCAGAACATGCCGCAGAG- 3'，INF-γ上游引物為5'- CGGCACAGTCATTG AAAGCCTA-3'，下游引物為5'- CGGCACAGTCA TTGAAAGCCTA-3'。以β- actin為內參對照，上游引物 為 5'- CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3'，下游引物為5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3'。研磨心臟組織勻漿后，按TRIzol說明書提取總RNA，測純度和濃度，按照Takara反轉錄試劑盒合成cDNA，然后按SYBR Green說明書進行實時PCR反應。檢測結果由SDS軟件進行分析。

2 結 果

2.1 第7天心臟移植物破壞程度及T細胞浸潤情況（圖1）：第7天時，收取同種同系組和同種異系組小鼠的移植心臟，行切片及HE染色，鏡下發(fā)現(xiàn)第7天時同種同系組的移植心臟組織肌纖維沒有受到破壞，沒有明顯炎癥細胞浸潤。而在同種異系組小鼠的移植心臟中，我們可以看到明顯的心肌組織受損和炎癥細胞浸潤。同時，充分研磨心臟組織勻漿后，進行流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，作為介導急性炎癥排斥反應的重要免疫細胞T細胞，在小鼠的移植心臟中，CD4+和CD8+T細胞表達均增多（圖2）。

圖1 心臟移植物HE染色結果

2.2 TIPE2在心臟移植物及T細胞中的表達情況（圖3）：從第7天的小鼠心臟移植物中提取RNA，逆轉錄后Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，相對于同種同系組，同種異系組小鼠的心臟TIPE2表達量出現(xiàn)了明顯的上調，因為TIPE2主要在免疫細胞中表達，而T細胞又是介導急性排斥反應的主要細胞，因此，我們推測心臟移植物中的TIPE2可能主要來自T細胞。我們取第7天移植小鼠脾臟提取脾細胞，利用免疫熒光技術定位CD4+/CD8+和TIPE2的關系，發(fā)現(xiàn)在CD4+或CD8+的T細胞中，同樣高表達TIPE2，這解釋了心臟移植物中TIPE2的升高可能來自浸潤的T細胞。

圖2 心臟移植物流式檢測CD4+及CD8+T細胞

2.3 心臟移植物中細胞因子明顯上調（圖4）：TIPE2作為免疫負調控因子，對于免疫細胞細胞因子的表達與分泌有著直接的影響。通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，由T細胞介導分泌的細胞因子IL-2和IFN-γ均在小鼠移植心臟中出現(xiàn)明顯的上調，提示了T細胞中TIPE2的表達可能與T細胞細胞因子的分泌具有一定的關系，從而介導了急性排斥反應過程的發(fā)生。

圖3 a為Real-time PCR檢測同種同系組，同種異系組小鼠第7天心臟移植物TIPE2表達水平；b為脾細胞免疫熒光染色CD4+、CD8+及TIPE2；與同種異系組相比，cP＜0.001

圖4 a、b為Rea-ltime PCR檢測同種同系組、同種異系組小鼠第7天心臟移植物IL-2和IFN-γ表達水平，與同種異系組相比，cP＜0.01，dP＜0.05

3 討 論

作為腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8家族的一員，TIPE2主要在造血以及淋巴組織中高表達，在穩(wěn)定免疫平衡中發(fā)揮著至關重要的作用［16-17］。在心臟移植排斥反應過程中，正是由于免疫平衡被打破，T細胞識別受體心臟抗原并產生免疫應答，從而導致移植物的失活［18］。我們前期通過一些研究發(fā)現(xiàn)，T細胞介導的急性免疫排斥與TIPE2之間可能存在一定的相關性，但其具體分子機制仍不明確。

我們發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟移植第7天，同種異系組的心臟移植物TIPE2表達量明顯高于同種同系組，而TIPE2表達量的提升正是由于介導急性免疫排斥反應的T細胞浸潤心臟組織而導致的。在心臟移植物中，浸潤的CD4+及CD8+T細胞可分泌眾多細胞因子，例如IL-2和IFN-γ等，導致排斥反應的級聯(lián)擴大，最終導致心臟移植物的失活［19-20］。Huang等［21］報道當T細胞中的TIPE2下調以后，能明顯促進IL-2和IFN-γ的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心臟移植第7天，心臟移植物中的細胞因子IL-2和IFN-γ表達量明顯增高，所以我們推測，TIPE2能通過調節(jié)T細胞在心臟移植物中細胞因子的分泌，從而影響急性免疫排斥的過程。

本實驗中，心臟移植物中的T細胞表達TIPE2，是心臟移植物TIPE2表達增高的主要原因，也提示了TIPE2與T細胞介導的急性排斥反應間的關系，能夠為以后臨床治療提供治療靶點，然而尚需進一步研究TIPE2與T細胞介導的急性排斥反應間的分子機制。